Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo simples para amostragem genética não invasiva de populações de borboletas com base na coleta de campo de detritos residuais de ovos. Pode ser usado para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a grupos mais amplos para o envolvimento da ciência comunitária.
Abstract
O declínio global de insetos continua a acelerar. A amostragem genética eficaz é extremamente necessária para avançar a compreensão de muitos táxons e abordar as lacunas de conhecimento existentes. Este protocolo representa um método demonstrado para amostragem não destrutiva de borboletas raras para análise de estrutura genética populacional ou DNA barcoding . Ele usa o córion de óvulos de borboletas eclodidas para produzir quantidade e DNA de qualidade suficientemente altas para o sequenciamento de genes bem-sucedido para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Pode ser particularmente útil quando outras técnicas de amostragem de tecidos são impraticáveis ou indisponíveis. Embora desenvolvido para um lepidóptero, no entanto, poderia ser facilmente adaptado para uso com outras espécies de insetos. Ele foi projetado especificamente com facilidade de uso como um objetivo para ajudar a maximizar a ampla implementação por indivíduos de diferentes níveis de experiência e habilidade, como cientistas comunitários, profissionais de conservação e estudantes, e para uso em grandes áreas geográficas para facilitar a ampla amostragem populacional. Os dados gerados podem ajudar a informar decisões taxonômicas e de listagem, ações de conservação e gerenciamento e aprimorar a pesquisa ecológica básica.
Introduction
A amostragem genética populacional eficaz de táxons de insetos raros, em declínio e/ou listados é muitas vezes crítica para ajudar a informar as ações de conservação e manejo. Métodos de amostragem de tecidos letais ou prejudiciais são rotineiramente utilizados para muitas análises genéticas. No entanto, esses métodos são indesejáveis ou não permitidos porque podem causar danos às populações vulneráveis existentes ou afetar negativamente o comportamento e a aptidão. Várias técnicas de amostragem não letais ou não invasivas envolvendo tecidos como pernas inteiras, recortes de antenas ou asas, exúvias larvais ou hemolinfa de secreções defensivas e outros produtos, como frass, têm sido adequadas para pesquisa genética de insetos 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . A viabilidade geral e a aplicabilidade dessas várias técnicas de amostragem de tecidos variam significativamente com base na biologia, ecologia, comportamento, tamanho e raridade do organismo focal, situação e indivíduos que coletam o material. Por exemplo, pernas inteiras ou recortes de apêndices exigem captura temporária e manuseio cuidadoso de vários indivíduos de um estágio de vida apropriado, normalmente por pessoal experiente. Da mesma forma, as fontes de tecido, como exúvios larvais ou frass, provavelmente só serão práticas se os organismos estiverem em cativeiro ou temporariamente mantidos por um período adequado.
Para questões de pesquisa que estão sendo feitas no nível da população, como aquelas relativas à potencial diferenciação taxonômica ou estrutura genética, a amostragem em uma escala temporal ou geográfica mais ampla (ou seja, regional ou continental) é frequentemente necessária. Como resultado, certas fontes de tecido não invasivas podem ser completamente impraticáveis ou, no mínimo, ineficientes para coletar em quantidade. A coleta de amostras em tais escalas também pode ser logisticamente ou financeiramente impraticável ou proibitiva para pesquisadores individuais ou mesmo equipes de campo menores empreenderem. Embora o envolvimento direto de cientistas comunitários tenha sido cada vez mais adotado pela comunidade de pesquisa para ajudar a enfrentar muitos desses desafios e acelerar a coleta orientada por big data, a adoção tem sido limitada para estudos envolvendo amostragem não destrutiva, não invasiva ou de eDNA10,11,12.
Para ajudar a superar algumas dessas limitações potenciais, demonstramos que o córion dos óvulos de borboleta eclodidos poderia produzir quantidade e qualidade de DNA suficientemente altas para o sequenciamento genético bem-sucedido para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Posteriormente, testamos vários protocolos de coleta utilizando essa técnica13. Este trabalho-piloto serviu de base para um maior aperfeiçoamento metodológico. Este artigo descreve em detalhes o protocolo de coleta de campo revisado e direto, mas abrangente, lançado para cientistas comunitários e outros funcionários não especializados. Este protocolo faz parte de uma análise da estrutura populacional de toda a gama da borboleta elfa congelada (Callophrys irus) para ajudar a informar futuras ações de conservação e uma determinação federal de possivelmente listagem sob a Lei de Espécies Ameaçadas dos EUA. Embora potencialmente mais trabalhoso do que alguns métodos não invasivos, a falta de contato necessário com o organismo e a facilidade de uso o tornam um modelo potencialmente viável que pode ser aplicado a outros programas de pesquisa genética populacional visando uma seleção de insetos comuns e aqueles de preocupação com a conservação, que deixam detritos residuais de ovos para trás de ninfas ou larvas recém-eclodidas. A linguagem protocolar aqui apresentada foi desenvolvida especificamente para borboletas da família Lycaenidae e para uso por não especialistas aqui definidos como cientistas comunitários ou outros indivíduos (por exemplo, biólogos de agências, estagiários) com experiência entomológica limitada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método de campo para amostragem não destrutiva de borboletas raras para estrutura genética populacional ou análises de código de barras de DNA. Os benefícios gerais deste protocolo são projetados especificamente para ajudar a maximizar a ampla implementação por indivíduos de diferentes níveis de experiência e habilidade, como cientistas comunitários, profissionais de conservação e estudantes. Isso inclui um custo geral relativamente baixo, suprimentos e equipamentos fáceis de adquirir, um método simples e acessível, sem inúmeras etapas excessivamente complexas e fácil implantação em uma ampla área geográfica. Além disso, tem como alvo o material orgânico residual que elimina a necessidade de capturar ou manipular temporariamente e, no processo, potencialmente prejudica os organismos vivos para adquirir amostras genéticas. Além disso, estende o período potencial disponível para a coleta de amostras além da fenologia tradicional ou da vida útil de um estágio de vida específico, aumentando a flexibilidade e a oportunidade geral de coleta para ajudar a maximizar o número de amostras.
Embora o táxon focal para esse esforço tenha sido a borboleta elfina fosca, um especialista em habitat generalizado, mas em declínio, esse protocolo pode ser aplicado de forma mais ampla a muitos outros insetos, incluindo aqueles de preocupação com a conservação. Da mesma forma, enquanto o protocolo visa a coleta de ovos eclodidos como fonte de material genético, ele pode ser facilmente adaptado a outras amostras potencialmente mais tradicionais (por exemplo, pernas, fragmentos de asas, clipes de antena) ou mesmo organismos inteiros. No entanto, esse aspecto também é uma potencial limitação do protocolo. Embora a grande maioria das etapas seja projetada para ser relativamente simples e rápida de realizar, pesquisar de forma abrangente manchas de plantas hospedeiras larvais para ovos de eclosão, que individualmente são tipicamente < 1,0 mm de diâmetro, é demorado e trabalhoso. No entanto, essa extensa atividade de amostragem é particularmente ideal para uma rede maior de participantes, como cientistas comunitários.
Tal como acontece com outros projetos baseados em campo, a preparação cuidadosa é essencial. Isso inclui a realização de um inventário completo dos suprimentos necessários para garantir que nenhum item esteja faltando, que qualquer trabalho de preparação necessário tenha sido concluído e que eles estejam bem organizados, embalados com segurança e prontos para a implantação em campo. Além disso, todo o pessoal de campo, particularmente aqueles que conduzem a coleta de tecidos, devem revisar o protocolo de coleta em detalhes antes de qualquer evento de coleta e abordar quaisquer perguntas aos indivíduos que supervisionam o projeto. Uma vez no campo, a parte de coleta de amostras do protocolo requer atenção meticulosa aos detalhes. Isso inclui localizar e inspecionar cuidadosamente quaisquer óvulos para garantir que eles estejam chocados e, portanto, apropriados para coleta, limpando completamente a pinça, substituindo luvas para ajudar a reduzir o transporte de tecido entre os eventos de amostragem e garantindo que as amostras de tecido sejam completamente submersas em tampão de lise dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Por fim, o registro de dados precisos e detalhados é essencial, o que inclui a vinculação da etiqueta de identificação exclusiva atribuída a partir do tubo de microcentrífuga, juntamente com a amostra específica coletada e todas as outras informações de coleta pertinentes. Embora esse passo seja rotineiro na pesquisa científica, muitas vezes precisa ser completamente esclarecido e reforçado para um público de ciência da comunidade.
Aqui, demonstramos o potencial de alavancagem de cientistas comunitários para a coleta de amostras não letais de espécies pequenas, raras e ameaçadas. No entanto, existem algumas limitações potenciais a ter em mente ao analisar quaisquer dados genéticos resultantes. Por exemplo, enquanto o agrupamento de amostras de um único adesivo aumenta as chances de recuperar DNA suficiente para detecção, ele também potencialmente introduz heterozigosidade. Além disso, como o protocolo envolve a coleta do córion de óvulos eclodidos, apenas borboletas fêmeas, representando o DNA parental, podem ser amostradas dentro de uma população. No entanto, como não havia dados genéticos anteriores em nível populacional disponíveis para o C. irus, os insights resultantes obtidos só podem beneficiar a conservação e o manejo das espécies. Por exemplo, enquanto um projeto de estudo completo e detalhado e uma seleção cuidadosa de marcadores seriam necessários para avaliar adequadamente a estrutura da população, o protocolo de amostragem descrito aqui e o uso de código de barras de DNA da subunidade 1 (CO1) da citocromo c oxidase poderiam ser usados para detectar a ocorrência de táxons raros ou em perigo. Discussões adicionais sobre a utilidade e aplicação do sequenciamento de DNA a partir de amostras não letais descritas aqui são detalhadas por Storer et. al.14.
Além do objetivo principal de coletar amostras para análise genética, o protocolo também enfatiza que os participantes tirem fotografias digitais detalhadas de todos os locais de campo, locais de coleta, plantas hospedeiras larvais presentes e quaisquer outros elementos do habitat circundante que possam ser relevantes. Essa documentação ajuda a fornecer uma avaliação geral do habitat que é útil para ilustrar as condições existentes do local, como fenologia de plantas, densidade de recursos do hospedeiro e histórico de gerenciamento (por exemplo, incêndio prescrito recentemente). Essas informações são particularmente úteis para projetos em que amostras de campo são coletadas durante um período temporal mais amplo, a fim de permitir comparações ambientais mais detalhadas.
Por fim, à medida que o declínio global de insetos continua a se acelerar, esforços expandidos de avaliação e monitoramento de espécies são extremamente necessários15,16. O uso de um envolvimento participativo mais generalizado de cientistas comunitários, estudantes (por exemplo, estagiários e bolsistas do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA) e profissionais de conservação oferece opções cada vez mais viáveis para a extensa coleta de dados de muitos tipos, incluindo amostras de DNA. Assim, os dados gerados a partir deste protocolo têm muitos usos possíveis. Isso inclui ajudar a informar ações de conservação (por exemplo, planejamento, recuperação e gerenciamento), listar decisões ou avaliações de status de espécies e pesquisas ecológicas, populacionais e taxonômicas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge e Jessup Weichelt pela ajuda com vários aspectos do projeto, incluindo logística, coordenação, permissão e / ou coleta de amostras. Esta pesquisa foi financiada através de uma doação do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA (Número de Identificação do Prêmio Federal F20AC00356) administrado pelo Wildlife Management Institute (subsídio SA 2021-01).
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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