Einsatz von Community-Wissenschaftlern zur Durchführung zerstörungsfreier genetischer Probenahmen seltener Schmetterlingspopulationen
Summary
Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für die nichtinvasive genetische Probenahme von Schmetterlingspopulationen, die auf der Feldsammlung von Resteierresten basiert. Es kann verwendet werden, um die Identität von Arten zu bestätigen und genetische Variation zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann leicht an breitere Gruppen für die Beteiligung der Community Science angepasst werden.
Abstract
Der weltweite Insektenrückgang beschleunigt sich weiter. Eine effektive genetische Probenahme ist von entscheidender Bedeutung, um das Verständnis vieler Taxa zu verbessern und bestehende Wissenslücken zu schließen. Dieses Protokoll stellt eine demonstrierte Methode zur zerstörungsfreien Probenahme seltener Schmetterlinge für populationsgenetische Struktur- oder DNA-Barcoding-Analysen dar. Es verwendet das Chorion von geschlüpften Schmetterlingseizellen, um ausreichend hohe Quantität und Qualität der DNA für eine erfolgreiche Gensequenzierung zu erhalten, um die Artidentität zu bestätigen und die genetische Variation zu quantifizieren. Es kann besonders nützlich sein, wenn andere Gewebeprobenahmetechniken nicht praktikabel oder nicht verfügbar sind. Obwohl es für einen Schmetterling entwickelt wurde, könnte es dennoch leicht für die Verwendung mit anderen Insektenarten angepasst werden. Es wurde speziell mit Benutzerfreundlichkeit entwickelt, um die breite Implementierung durch Personen mit unterschiedlichen Erfahrungen und Fähigkeiten, wie z. B. Gemeindewissenschaftler, Naturschutzpraktiker und Studenten, zu maximieren und über große geografische Gebiete hinweg zu verwenden, um eine breite Populationsprobenahme zu erleichtern. Die generierten Daten können dazu beitragen, taxonomische und Listungsentscheidungen, Erhaltungs- und Managementmaßnahmen zu treffen und die ökologische Grundlagenforschung zu verbessern.
Introduction
Eine effektive populationsgenetische Probenahme seltener, rückläufiger und/oder gelisteter Insektentaxa ist oft entscheidend, um Erhaltungs- und Managementmaßnahmen zu unterstützen. Tödliche oder schädliche Gewebeentnahmemethoden werden routinemäßig für viele genetische Analysen verwendet. Diese Methoden sind jedoch unerwünscht oder nicht erlaubt, da sie gefährdeten Bevölkerungsgruppen Schaden zufügen oder Verhalten und Fitness negativ beeinflussen können. Verschiedene nichtletale oder nichtinvasive Probenahmetechniken mit Gewebe wie ganzen Beinen, Antennen- oder Flügelschnitt, Larvenexuvien oder Hämolymphen aus Abwehrsekreten und anderen Produkten wie Frass waren für die insektengenetische Forschung geeignet 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Die allgemeine Durchführbarkeit und Anwendbarkeit dieser verschiedenen Gewebeprobenahmetechniken variiert erheblich je nach Biologie, Ökologie, Verhalten, Größe und Seltenheit des fokalen Organismus, der Situation und der Personen, die das Material sammeln. Zum Beispiel erfordern ganze Beine oder Anhangsausschnitte die vorübergehende Erfassung und sorgfältige Handhabung mehrerer Personen einer geeigneten Lebensphase, typischerweise durch erfahrenes Personal. Ebenso sind Gewebequellen wie Larvenexuvien oder Frass wahrscheinlich nur dann praktikabel, wenn sich die Organismen in Gefangenschaft befinden oder vorübergehend für einen angemessenen Zeitraum gehalten werden.
Für Forschungsfragen, die auf Populationsebene gestellt werden, z. B. in Bezug auf mögliche taxonomische Differenzierung oder genetische Struktur, ist häufig eine Stichprobe auf einer breiteren zeitlichen oder geografischen Skala (d.h. regional oder kontinental) erforderlich. Infolgedessen können bestimmte nichtinvasive Gewebequellen völlig unpraktisch oder zumindest ineffizient in der Menge gesammelt werden. Die Probenentnahme in solchen Größenordnungen kann zusätzlich logistisch oder finanziell unpraktisch oder für einzelne Forscher oder sogar kleinere Feldteams unerschwinglich sein. Während das direkte Engagement von Community-Wissenschaftlern zunehmend von der Forschungsgemeinschaft übernommen wurde, um viele dieser Herausforderungen anzugehen und die Sammlung von Big Data zu beschleunigen, war die Akzeptanz für Studien mit zerstörungsfreien, nichtinvasiven oder eDNA-Proben begrenzt10,11,12.
Um einige dieser potenziellen Einschränkungen zu überwinden, haben wir gezeigt, dass das Chorion aus geschlüpften Schmetterlingseizellen eine ausreichend hohe Quantität und Qualität der DNA für eine erfolgreiche Gensequenzierung liefern kann, um die Artidentität zu bestätigen und die genetische Variation zu quantifizieren. Anschließend testeten wir verschiedene Sammelprotokolle mit dieser Technik13. Diese Pilotarbeiten dienten als Grundlage für eine weitere methodische Verfeinerung. Dieses Papier beschreibt detailliert das daraus resultierende einfache, aber umfassende überarbeitete Feldsammlungsprotokoll, das für Gemeindewissenschaftler und anderes nicht-fachkundiges Personal eingeführt wurde. Dieses Protokoll ist Teil einer bereichsweiten Populationsstrukturanalyse des Milchelfenfalters (Callophrys irus), um zukünftige Erhaltungsmaßnahmen und eine bundesweite Entscheidung über eine mögliche Aufnahme in die Liste unter dem U.S. Endangered Species Act zu unterstützen. Obwohl es potenziell arbeitsintensiver ist als einige nichtinvasive Methoden, machen der Mangel an notwendigem Organismenkontakt und die Benutzerfreundlichkeit es zu einem potenziell praktikablen Modell, das auf andere populationsgenetische Forschungsprogramme angewendet werden kann, die auf eine Auswahl sowohl gewöhnlicher Insekten als auch solcher von Naturschutzbesorgnis abzielen, die Reste von Eierresten von kürzlich geschlüpften Nymphen oder Larven hinterlassen. Die hier vorgestellte Protokollsprache wurde speziell für Schmetterlinge der Familie Lycaenidae entwickelt und für die Verwendung durch Nicht-Experten, die hier als Community-Wissenschaftler oder andere Personen (z. B. Agenturbiologen, Praktikanten) mit begrenzter entomologischer Erfahrung definiert sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Feldmethode zur zerstörungsfreien Probenahme seltener Schmetterlinge für populationsgenetische Struktur- oder DNA-Barcoding-Analysen. Die allgemeinen Vorteile dieses Protokolls wurden speziell entwickelt, um die breite Implementierung durch Personen mit unterschiedlichen Erfahrungen und Fähigkeiten wie Gemeindewissenschaftler, Naturschutzpraktiker und Studenten zu maximieren. Dazu gehören relativ niedrige Gesamtkosten, einfach zu beschaffende Verbrauchsmaterialien und Ausrüstung, eine einfache und zugängliche Methode ohne zahlreiche übermäßig komplexe Schritte und eine einfache Bereitstellung in einem breiten geografischen Gebiet. Es zielt auch auf organisches Restmaterial ab, das die Notwendigkeit beseitigt, vorübergehend zu fangen oder zu manipulieren, und dabei möglicherweise lebende Organismen schädigt, um genetische Proben zu erwerben. Darüber hinaus verlängert es den potenziellen Zeitraum, der für die Probenentnahme zur Verfügung steht, über die traditionelle Phänologie oder Lebensdauer einer bestimmten Lebensphase hinaus, wodurch die Flexibilität und die allgemeine Sammelmöglichkeit verbessert werden, um die Probenzahlen zu maximieren.
Während das zentrale Taxon für diese Bemühungen der gefrorene Elfenfalter war, ein weit verbreiteter, aber rückläufiger Habitatspezialist, kann dieses Protokoll breiter auf viele andere Insekten angewendet werden, einschließlich derjenigen, die für den Naturschutz von Belang sind. Während das Protokoll auf die Sammlung von geschlüpften Eiern als Quelle für genetisches Material abzielt, kann es leicht an andere, möglicherweise traditionellere Proben (z. B. Beine, Flügelfragmente, Antennenclips) oder sogar ganze Organismen angepasst werden. Dieser Aspekt ist jedoch auch eine mögliche Einschränkung des Protokolls. Obwohl die überwiegende Mehrheit der Schritte relativ einfach und schnell durchzuführen ist, ist die umfassende Suche nach Larvenwirtspflanzen, die einzeln typischerweise <1,0 mm Durchmesser haben, zeit- und arbeitsintensiv. Nichtsdestotrotz ist eine solche umfangreiche Probenahmeaktivität besonders ideal für ein größeres Netzwerk von Teilnehmern wie Community Scientists.
Wie bei anderen Projekten vor Ort ist eine sorgfältige Vorbereitung unerlässlich. Dazu gehört die Durchführung einer vollständigen Bestandsaufnahme der benötigten Vorräte, um sicherzustellen, dass keine Artikel fehlen, alle erforderlichen Vorbereitungsarbeiten abgeschlossen sind und sie gut organisiert, sicher verpackt und für den Feldeinsatz bereit sind. Darüber hinaus sollten alle Mitarbeiter vor Ort, insbesondere diejenigen, die die Gewebeentnahme durchführen, das Entnahmeprotokoll vor jeder Entnahmeveranstaltung im Detail überprüfen und Fragen an Personen richten, die das Projekt beaufsichtigen. Einmal vor Ort, erfordert der Probenentnahmeteil des Protokolls akribische Liebe zum Detail. Dazu gehört das Auffinden und sorgfältige Inspizieren von Eizellen, um sicherzustellen, dass sie geschlüpft sind und somit für die Entnahme geeignet sind, die gründliche Reinigung der Pinzette, das Ersetzen von Handschuhen, um die Gewebeverschleppung zwischen den Probenahmeereignissen zu reduzieren, und die Sicherstellung, dass Gewebeproben vollständig in den Lysepuffer in jedem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingetaucht sind. Schließlich ist die Aufzeichnung genauer und detaillierter Daten unerlässlich, einschließlich der Verknüpfung des eindeutigen ID-Etiketts, das aus dem Mikrozentrifugenröhrchen zugewiesen wurde, mit der spezifischen entnommenen Probe und allen anderen relevanten Entnahmeinformationen. Während dieser Schritt in der wissenschaftlichen Forschung Routine ist, muss er für ein Community-Science-Publikum oft gründlich geklärt und verstärkt werden.
Hier demonstrieren wir das Potenzial von Community-Wissenschaftlern für die nicht-tödliche Probensammlung von kleinen, seltenen und bedrohten Arten. Es gibt jedoch einige mögliche Einschränkungen, die bei der Analyse der resultierenden genetischen Daten zu beachten sind. Während beispielsweise das Poolen von Proben aus einem einzigen Pflaster die Chancen erhöht, genügend DNA für den Nachweis zu gewinnen, führt es möglicherweise auch zu Heterozygotie. Da das Protokoll das Sammeln des Chorions aus geschlüpften Eizellen beinhaltet, können nur weibliche Schmetterlinge, die elterliche DNA repräsentieren, innerhalb einer Population entnommen werden. Da jedoch keine genetischen Daten auf Populationsebene für C. irus verfügbar waren, können die daraus gewonnenen Erkenntnisse nur dem Artenschutz und -management zugute kommen. Während beispielsweise ein gründliches, detailliertes Studiendesign und eine sorgfältige Auswahl der Marker erforderlich wären, um die Populationsstruktur angemessen zu beurteilen, könnten das hier beschriebene Probenahmeprotokoll und die Verwendung von Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit 1 (CO1) DNA-Barcoding verwendet werden, um das Auftreten seltener oder gefährdeter Taxa nachzuweisen. Weitere Erörterungen des Nutzens und der Anwendung der DNA-Sequenzierung aus nicht-letalen Proben, die hier beschrieben werden, werden von Storer et ausführlich beschrieben. al.14.
Neben dem primären Ziel, Proben für die genetische Analyse zu sammeln, betont das Protokoll auch, dass die Teilnehmer detaillierte digitale Fotos aller Feldstandorte, Sammelorte, vorhandenen Larvenwirtspflanzen und aller anderen Elemente des umgebenden Lebensraums machen, die relevant sein könnten. Eine solche Dokumentation hilft bei der Erstellung einer allgemeinen Bewertung des Lebensraums, die nützlich ist, um bestehende Standortbedingungen wie Pflanzenphänologie, Wirtsressourcendichte und Managementgeschichte (z. B. kürzlich vorgeschriebene Brände) zu veranschaulichen. Solche Informationen sind besonders nützlich für Projekte, bei denen Feldproben über einen längeren Zeitraum entnommen werden, um detailliertere Umweltvergleiche zu ermöglichen.
Da sich der weltweite Insektenrückgang weiter beschleunigt, sind schließlich erweiterte Artenbewertungs- und Überwachungsbemühungen dringend erforderlich15,16. Die Nutzung eines breiteren partizipativen Engagements von Gemeindewissenschaftlern, Studenten (z. B. Praktikanten und Stipendiaten des U.S. Fish and Wildlife Service) und Naturschutzpraktikern bietet zunehmend praktikable Optionen für eine umfassende Datensammlung vieler Arten, einschließlich DNA-Proben. Dementsprechend haben die aus diesem Protokoll generierten Daten viele Einsatzmöglichkeiten. Dazu gehören die Unterstützung von Erhaltungsmaßnahmen (z. B. Planung, Wiederherstellung und Management), Listenentscheidungen oder Bewertungen des Artenstatus sowie ökologische, populationsbezogene und taxonomische Forschung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge und Jessup Weichelt für die Hilfe bei verschiedenen Aspekten des Projekts, einschließlich Logistik, Koordination, Genehmigung und / oder Probenentnahme. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) finanziert, der vom Wildlife Management Institute verwaltet wird (Grant SA 2021-01).
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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