Acoustophorèse microfluidique pour la séparation en continu de bactéries à Gram négatif à l’aide de billes d’affinité aptamères
Summary
Cet article décrit la fabrication et le fonctionnement de puces acoustophorétiques microfluidiques à l’aide de la technique de l’acoustophorèse microfluidique et de microbilles modifiées par aptamères qui peuvent être utilisées pour isoler rapidement et efficacement les bactéries à Gram négatif d’un milieu.
Abstract
Cet article décrit la fabrication et le fonctionnement de puces acoustophorétiques microfluidiques à l’aide d’une technique d’acoustophorèse microfluidique et de microbilles modifiées par aptamère qui peuvent être utilisées pour l’isolement rapide et efficace des bactéries à Gram négatif à partir d’un milieu. Cette méthode améliore l’efficacité de séparation en utilisant un mélange de longs microcanaux carrés. Dans ce système, l’échantillon et le tampon sont injectés dans l’orifice d’entrée via un régulateur de débit. Pour le centrage du cordon et la séparation des échantillons, l’alimentation CA est appliquée au transducteur piézoélectrique via un générateur de fonctions avec un amplificateur de puissance pour générer une force de rayonnement acoustique dans le microcanal. Il y a un canal bifurqué à l’entrée et à la sortie, permettant la séparation, la purification et la concentration simultanées. L’appareil a un taux de récupération de >98% et une pureté de 97,8% jusqu’à une concentration de dose 10x. Cette étude a démontré un taux de récupération et une pureté supérieurs aux méthodes existantes de séparation des bactéries, ce qui suggère que le dispositif peut séparer efficacement les bactéries.
Introduction
Des plates-formes microfluidiques sont en cours de développement pour isoler les bactéries à partir d’échantillons médicaux et environnementaux, en plus des méthodes basées sur le transfert diélectrique, la magnétophorèse, l’extraction des billes, le filtrage, la microfluidique centrifuge et les effets inertiels, et les ondes acoustiques de surface 1,2. La détection des bactéries pathogènes se poursuit à l’aide de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), mais elle est généralement laborieuse, complexe et prend beaucoupde temps 3,4. Les systèmes d’acoustophorèse microfluidique sont une solution de rechange pour résoudre ce problème grâce à un débit raisonnable et à une isolation cellulaire sans contact 5,6,7. L’acoustophorèse est une technologie qui sépare ou concentre les perles en utilisant le phénomène du mouvement de la matière à travers une onde sonore. Lorsque les ondes sonores pénètrent dans le microcanal, elles sont triées en fonction de la taille, de la densité, etc., des billes, et les cellules peuvent être séparées en fonction des propriétés biochimiques et électriques du milieu en suspension 7,8. En conséquence, de nombreuses études acoustophorétiques ont été activement poursuivies 9,10,11, et récemment, des simulations numériques 3D du mouvement acoustophorétique induit par l’écoulement acoustique entraîné par les limites dans la microfluidique à ondes acoustiques de surface debout ont été introduites 12.
Des études dans divers domaines examinent comment remplacer les anticorps 2,3. L’aptamère est un matériau cible ayant une sélectivité et une spécificité élevées, et de nombreuses études sont en cours 2,9,10,13. Les aptamères présentent des avantages de petite taille, d’excellente stabilité biologique, de faible coût et de reproductibilité élevée par rapport aux anticorps et sont étudiés dans des applications diagnostiques et thérapeutiques 2,3,14.
Ici, cet article décrit un protocole technologique d’acoustophorèse microfluidique qui peut être utilisé pour la séparation rapide et efficace des bactéries à Gram négatif (GN) d’un milieu à l’aide de microbilles modifiées par aptamère. Ce système génère une onde stationnaire acoustique bidimensionnelle (2D) par actionnement piézoélectrique unique en stimulant simultanément deux résonances orthogonales dans un long microcanal rectangulaire pour aligner et concentrer les microbilles attachées aux aptamères au niveau du nœud et des points anti-nœuds pour l’efficacité de séparation 2,11,15,16 . Il y a un canal bifurqué à l’entrée et à la sortie, permettant la séparation, la purification et la concentration simultanées.
Ce protocole peut être utile dans le domaine du diagnostic précoce des maladies infectieuses bactériennes, ainsi que d’une réponse rapide, sélective et sensible aux infections bactériennes pathogènes grâce à la surveillance de l’eau en temps réel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé un dispositif microfluidique à lévitation sonique pour capturer et transférer les bactéries GN à partir d’échantillons de culture à grande vitesse basé sur une méthode de fonctionnement continu en fonction de leur taille et de leur type, et des microbilles modifiées par aptamère. Le microcanal long et carré permet une conception plus simple et une plus grande rentabilité pour l’acoustophorèse2D que précédemment rapporté 20,21,22,23,24,25,26.<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (ministère des Sciences et des TIC). (Non. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
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