Microfluïdische Acoustophorese voor flowthrough scheiding van gramnegatieve bacteriën met behulp van Aptamer Affinity Beads
Summary
Dit artikel beschrijft de fabricage en werking van microfluïdische acoustophoretische chips met behulp van de microfluïdische acoustophoresis-techniek en aptamer-gemodificeerde microbeads die kunnen worden gebruikt voor snelle, efficiënte isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit een medium.
Abstract
Dit artikel beschrijft de fabricage en werking van microfluïdische acoustophoretische chips met behulp van een microfluïdische acoustophoresis-techniek en aptamer-gemodificeerde microbeads die kunnen worden gebruikt voor de snelle, efficiënte isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit een medium. Deze methode verbetert de scheidingsefficiëntie met behulp van een mix van lange, vierkante microkanalen. In dit systeem worden het monster en de buffer via een stroomregelaar in de inlaatpoort geïnjecteerd. Voor kraalcentrering en monsterscheiding wordt wisselstroom toegepast op de piëzo-elektrische transducer via een functiegenerator met een eindversterker om akoestische stralingskracht in het microkanaal te genereren. Er is een gespleten kanaal bij zowel de inlaat als de uitlaat, waardoor gelijktijdige scheiding, zuivering en concentratie mogelijk is. Het apparaat heeft een herstelpercentage van >98% en een zuiverheid van 97,8% tot een dosisconcentratie van 10x. Deze studie heeft een herstelsnelheid en zuiverheid aangetoond die hoger is dan de bestaande methoden voor het scheiden van bacteriën, wat suggereert dat het apparaat bacteriën efficiënt kan scheiden.
Introduction
Microfluïdische platforms worden ontwikkeld om bacteriën te isoleren uit medische en omgevingsmonsters, naast methoden op basis van diëlektrische overdracht, magnetoforese, kraalextractie, filtering, centrifugale microfluïdica en traagheidseffecten, en oppervlakteakoestische golven 1,2. De detectie van pathogene bacteriën wordt voortgezet met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), maar het is meestal bewerkelijk, complex en tijdrovend 3,4. Microfluïdische acoustophoresesystemen zijn een alternatief om dit aan te pakken door middel van een redelijke doorvoer en contactloze celisolatie 5,6,7. Acoustophoresis is een technologie die kralen scheidt of concentreert met behulp van het fenomeen van materiële beweging door middel van een geluidsgolf. Wanneer geluidsgolven het microkanaal binnenkomen, worden ze gesorteerd op basis van de grootte, dichtheid, enz., van de kralen, en cellen kunnen worden gescheiden volgens de biochemische en elektrische eigenschappen van het suspensiemedium 7,8. Dienovereenkomstig zijn veel acoustophoretische studies actief uitgevoerd 9,10,11, en onlangs zijn 3D numerieke simulaties van acoustophoretische beweging geïnduceerd door grensgestuurde akoestische streaming in staande akoestische golfmicrofluïdica geïntroduceerd12.
Studies op verschillende gebieden onderzoeken hoe antilichamen kunnen worden vervangen 2,3. Aptamer is een doelmateriaal met een hoge selectiviteit en specificiteit, en er worden veel studies uitgevoerd 2,9,10,13. Aptameren hebben voordelen van klein formaat, uitstekende biologische stabiliteit, lage kosten en hoge reproduceerbaarheid in vergelijking met antilichamen en worden bestudeerd in diagnostische en therapeutische toepassingen 2,3,14.
Hier beschrijft dit artikel een microfluïdisch acoustophoresis-technologieprotocol dat kan worden gebruikt voor de snelle, efficiënte scheiding van Gram-negatieve (GN) bacteriën uit een medium met behulp van aptamer-gemodificeerde microbeads. Dit systeem genereert een tweedimensionale (2D) akoestische staande golf door middel van enkele piëzo-elektrische activering door tegelijkertijd twee orthogonale resonanties in een lang rechthoekig microkanaal te stimuleren om aptamer-bevestigde microbeads uit te lijnen en te focussen op de knoop en anti-knooppuntpunten voor scheidingsefficiëntie 2,11,15,16 . Er is een gespleten kanaal bij zowel de inlaat als de uitlaat, waardoor gelijktijdige scheiding, zuivering en concentratie mogelijk is.
Dit protocol kan nuttig zijn op het gebied van vroege diagnose van bacteriële infectieziekten, evenals een snelle, selectieve en gevoelige reactie op pathogene bacteriële infecties door middel van real-time watermonitoring.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een sonische levitatie microfluïdisch apparaat voor het vangen en overbrengen van GN-bacteriën uit kweekmonsters met hoge snelheid op basis van een continu lopende methode op basis van hun grootte en type, en aptamer-gemodificeerde microbeads. Het lange, vierkante microkanaal maakt een eenvoudiger ontwerp en een grotere kostenefficiëntie voor 2D-acoustophorese mogelijk dan eerder gemeld 20,21,22,23,24,25,26.<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (Ministerie van Wetenschap en ICT). (Nee. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
