الرحلان الصوتي الموائع الدقيقة للفصل المتدفق للبكتيريا سالبة الجرام باستخدام حبات تقارب أبتامر
Summary
تصف هذه الورقة تصنيع وتشغيل رقائق التحلل الصوتي الموائع الدقيقة باستخدام تقنية الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة والميكروبيدات المعدلة بواسطة aptamer والتي يمكن استخدامها للعزل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام من الوسط.
Abstract
توضح هذه المقالة تصنيع وتشغيل رقائق الرحلان الأكوستوفورتيك الموائع الدقيقة باستخدام تقنية الرحلان الأجوستوفوريزي الموائع الدقيقة والميكروبيدات المعدلة بواسطة aptamer والتي يمكن استخدامها للعزل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام من الوسط. تعزز هذه الطريقة كفاءة الفصل باستخدام مزيج من القنوات الدقيقة الطويلة والمربعة. في هذا النظام، يتم حقن العينة والمخزن المؤقت في منفذ المدخل من خلال وحدة تحكم في التدفق. بالنسبة لتمركز الخرز وفصل العينات، يتم تطبيق طاقة التيار المتردد على محول الطاقة الكهرضغطية عبر مولد وظيفي مع مضخم طاقة لتوليد قوة إشعاع صوتي في القناة الدقيقة. هناك قناة متشعبة في كل من المدخل والمخرج ، مما يتيح الفصل والتنقية والتركيز في وقت واحد. يحتوي الجهاز على معدل استرداد يبلغ >98٪ ونقاء 97.8٪ حتى تركيز جرعة 10x. أظهرت هذه الدراسة معدل استرداد ونقاء أعلى من الطرق الحالية لفصل البكتيريا ، مما يشير إلى أن الجهاز يمكنه فصل البكتيريا بكفاءة.
Introduction
ويجري تطوير منصات الموائع الدقيقة لعزل البكتيريا عن العينات الطبية والبيئية، بالإضافة إلى الطرق القائمة على النقل العازل للكهرباء، والرحلان المغناطيسي، واستخراج الخرز، والترشيح، والموائع الدقيقة بالطرد المركزي والتأثيرات بالقصور الذاتي، والموجات الصوتية السطحية 1,2. يستمر الكشف عن البكتيريا المسببة للأمراض باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ولكنه عادة ما يكون شاقا ومعقدا ومستهلكا للوقت 3,4. تعد أنظمة الرحلان الأيكولومبي الموائع الدقيقة بديلا لمعالجة ذلك من خلال الإنتاجية المعقولة وعزل الخلايا غير الملامسة5،6،7. الرحلان الصوتي هو تقنية تفصل أو تركز الخرز باستخدام ظاهرة حركة المواد من خلال موجة صوتية. عندما تدخل الموجات الصوتية إلى القناة الدقيقة ، يتم فرزها وفقا لحجم الخرز وكثافته وما إلى ذلك ، ويمكن فصل الخلايا وفقا للخصائص الكيميائية الحيوية والكهربائية لوسط التعليق 7,8. وفقا لذلك ، تم متابعة العديد من الدراسات الصوتية بنشاط9،10،11 ، ومؤخرا ، تم إدخال المحاكاة العددية ثلاثية الأبعاد للحركة الصوتية الناجمة عن التدفق الصوتي المدفوع بالحدود في الموائع الدقيقة للموجة الصوتية السطحية الدائمة12.
تدرس الدراسات في مختلف المجالات كيفية استبدال الأجسام المضادة 2,3. Aptamer هي مادة مستهدفة ذات انتقائية وخصوصية عالية ، ويتم إجراء العديد من الدراسات2،9،10،13. تتميز Aptamers بصغر حجمها ، والاستقرار البيولوجي الممتاز ، والتكلفة المنخفضة ، وقابلية التكاثر العالية مقارنة بالأجسام المضادة ويتم دراستها في التطبيقات التشخيصية والعلاجية2،3،14.
هنا ، تصف هذه المقالة بروتوكول تقنية الرحلان الأكوستوفوريزي الموائع الدقيقة التي يمكن استخدامها للفصل السريع والفعال للبكتيريا سالبة الجرام (GN) عن وسط باستخدام الميكروبيدات المعدلة بواسطة aptamer. يولد هذا النظام موجة صوتية دائمة ثنائية الأبعاد (2D) من خلال تشغيل كهرضغطي واحد عن طريق تحفيز رنين متعامدين في وقت واحد داخل قناة دقيقة مستطيلة طويلة لمحاذاة وتركيز الميكروبيدات المرتبطة ب aptamer في العقدة ونقاط مضادة للعقدة لكفاءة الفصل 2,11,15,16 . هناك قناة متشعبة في كل من المدخل والمخرج ، مما يتيح الفصل والتنقية والتركيز في وقت واحد.
يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا في مجال التشخيص المبكر للأمراض المعدية البكتيرية ، بالإضافة إلى استجابة سريعة وانتقائية وحساسة للعدوى البكتيرية المسببة للأمراض من خلال مراقبة المياه في الوقت الفعلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير جهاز الموائع الدقيقة للرفع الصوتي لالتقاط ونقل بكتيريا GN من عينات المستنبتة بسرعة عالية استنادا إلى طريقة تشغيل مستمرة وفقا لحجمها ونوعها ، والميكروبيدات المعدلة بواسطة aptamer. تتيح القناة الدقيقة المربعة الطويلة تصميما أبسط وكفاءة أكبر من حيث التكلفة للهروب الحرقفي ثنائي الأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) التي تمولها الحكومة الكورية (وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات). (لا. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
