Mikrofluidische Akustophorese zur Durchflusstrennung gramnegativer Bakterien mittels Aptamer Affinity Beads
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Betrieb von mikrofluidischen akustophoretischen Chips unter Verwendung der mikrofluidischen Akustophorese-Technik und Aptamer-modifizierten Mikroperlen, die zur schnellen und effizienten Isolierung gramnegativer Bakterien aus einem Medium verwendet werden können.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Betrieb von mikrofluidischen akustophoretischen Chips unter Verwendung einer mikrofluidischen Akustophoresetechnik und Aptamer-modifizierten Mikroperlen, die für die schnelle, effiziente Isolierung gramnegativer Bakterien aus einem Medium verwendet werden können. Diese Methode erhöht die Trenneffizienz durch eine Mischung aus langen, quadratischen Mikrokanälen. Bei diesem System werden die Probe und der Puffer über einen Durchflussregler in den Einlassanschluss injiziert. Für die Perlenzentrierung und Probentrennung wird über einen Funktionsgenerator mit Leistungsverstärker Wechselstrom an den piezoelektrischen Wandler angelegt, um eine akustische Strahlungskraft im Mikrokanal zu erzeugen. Sowohl am Ein- als auch am Auslass befindet sich ein gegabelter Kanal, der eine gleichzeitige Trennung, Reinigung und Konzentration ermöglicht. Das Gerät hat eine Wiederfindungsrate von >98% und eine Reinheit von 97,8% bis zu einer 10-fachen Dosiskonzentration. Diese Studie hat eine höhere Wiederfindungsrate und Reinheit als die bestehenden Methoden zur Trennung von Bakterien gezeigt, was darauf hindeutet, dass das Gerät Bakterien effizient trennen kann.
Introduction
Mikrofluidische Plattformen werden entwickelt, um Bakterien aus medizinischen und Umweltproben zu isolieren, zusätzlich zu Methoden, die auf dielektrischem Transfer, Magnetophorese, Perlenextraktion, Filterung, zentrifugaler Mikrofluidik und Trägheitseffekten sowie akustischen Oberflächenwellen basieren 1,2. Der Nachweis pathogener Bakterien wird mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) fortgesetzt, ist aber in der Regel mühsam, komplex und zeitaufwendig 3,4. Mikrofluidische Akustophoresesysteme sind eine Alternative, um dies durch angemessenen Durchsatz und berührungslose Zellisolierung zu beheben 5,6,7. Die Akustophorese ist eine Technologie, die Perlen unter Verwendung des Phänomens der materiellen Bewegung durch eine Schallwelle trennt oder konzentriert. Wenn Schallwellen in den Mikrokanal eintreten, werden sie nach Größe, Dichte usw. der Perlen sortiert, und Zellen können nach den biochemischen und elektrischen Eigenschaften des Suspensionsmediums 7,8 getrennt werden. Dementsprechend wurden viele akustophoretische Studien aktiv durchgeführt 9,10,11, und kürzlich wurden numerische 3D-Simulationen akustophoretischer Bewegungen, die durch grenzgetriebenes akustisches Strömen in der Mikrofluidik der akustischen Wellen stehender Oberfläche induziert wurden, eingeführt 12.
Studien in verschiedenen Bereichen untersuchen, wie Antikörperersetzt werden können 2,3. Aptamer ist ein Zielmaterial mit hoher Selektivität und Spezifität, und viele Studien werden durchgeführt 2,9,10,13. Aptamere haben Vorteile von geringer Größe, ausgezeichneter biologischer Stabilität, niedrigen Kosten und hoher Reproduzierbarkeit im Vergleich zu Antikörpern und werden in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen untersucht 2,3,14.
Hier beschreibt dieser Artikel ein mikrofluidisches Akustophorese-Technologieprotokoll, das für die schnelle, effiziente Trennung von gramnegativen (GN) Bakterien aus einem Medium unter Verwendung von Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen verwendet werden kann. Dieses System erzeugt eine zweidimensionale (2D) akustische stehende Welle durch einzelne piezoelektrische Betätigung, indem es gleichzeitig zwei orthogonale Resonanzen innerhalb eines langen rechteckigen Mikrokanals stimuliert, um Aptamer-gebundene Mikroperlen an den Knoten- und Antiknotenpunkten für die Trenneffizienz auszurichten und zu fokussieren 2,11,15,16 . Sowohl am Ein- als auch am Auslass befindet sich ein gegabelter Kanal, der eine gleichzeitige Trennung, Reinigung und Konzentration ermöglicht.
Dieses Protokoll kann im Bereich der Früherkennung bakterieller Infektionskrankheiten sowie einer schnellen, selektiven und empfindlichen Reaktion auf pathogene bakterielle Infektionen durch Echtzeit-Wasserüberwachung hilfreich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwickelten ein mikrofluidisches Schallschwebegerät zum Einfangen und Übertragen von GN-Bakterien aus Kulturproben mit hoher Geschwindigkeit, basierend auf einer kontinuierlichen Laufmethode entsprechend ihrer Größe und Art und Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen. Der lange, quadratische Mikrokanal ermöglicht ein einfacheres Design und eine höhere Kosteneffizienz für die 2D-Akustophorese als bisher berichtet 20,21,22,23,24,25,26.<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die von der koreanischen Regierung (Ministerium für Wissenschaft und IKT) finanziert wird. (Nein. NRF-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
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