התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.
Abstract
תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) הם כלי מצוין לחקר התפתחות מוקדמת של הלבלב ולחקר התורמים הגנטיים לסוכרת. תאים מפרישי אינסולין שמקורם ב-hPSC יכולים להיווצר לצורך טיפול בתאים ומידול מחלות, עם יעילות מוגבלת ותכונות תפקודיות. אבות לבלב שמקורם ב-hPSC שהם מבשרי תאי בטא ותאים אנדוקריניים אחרים, כאשר מבטאים במשותף את שני גורמי השעתוק PDX1 ו-NKX6.1, מציינים את אבות האב לתאי בטא מתפקדים המפרישים אינסולין הן במבחנה והן ב-in vivo. אבות לבלב שמקורם ב-hPSC משמשים כיום לטיפול בתאים בחולי סוכרת מסוג 1 כחלק מניסויים קליניים. עם זאת, ההליכים הנוכחיים אינם מייצרים שיעור גבוה של NKX6.1 ואבות לבלב, מה שמוביל לייצור משותף של תאים אנדוקריניים לא מתפקדים ומעט תאים מגיבים לגלוקוז ומפרישי אינסולין. עבודה זו פיתחה אפוא פרוטוקול משופר ליצירת אבות לבלב שמקורם ב-hPSC, אשר ממקסמים את הביטוי המשותף של PDX1 ו-NKX6.1 במונו-שכבה דו-ממדית. הגורמים כגון צפיפות תאים, זמינות של מטריצה טרייה ודיסוציאציה של תאים אנדודרמליים שמקורם ב-hPSC מווסתים שהגדילו את רמות PDX1 ו-NKX6.1 באבות הלבלב שנוצרו וצמצמו את המחויבות לשושלת הכבד החלופית. המחקר מדגיש כי מניפולציה של הסביבה הפיזית של התא במהלך התמיינות במבחנה יכולה להשפיע על מפרט השושלת ועל ביטוי הגנים. לכן, הפרוטוקול הממוטב הנוכחי מאפשר את הדור הניתן להרחבה של PDX1 ו- NKX6.1 המבטאים צאצאים משותפים לטיפול בתאים ומידול מחלות.
Introduction
סוכרת היא הפרעה מטבולית מורכבת המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם. תוספת של אינסולין נחשבת לאפשרות הטיפול היחידה בסוכרת. מקרים מתקדמים יותר מטופלים באמצעות טיפול בהחלפת תאי בטא, המושג באמצעות השתלת לבלב שלם או איים 1,2. מספר סוגיות מקיפות את הטיפול בהשתלה, כגון הגבלה בזמינות ובאיכות הרקמה, פולשנות של הליכי השתלה בנוסף לצורך המתמשך בתרופות מדכאות חיסון. זה מחייב את הצורך בגילוי אפשרויות חדשניות ואלטרנטיביות לטיפול בתחליפי תאי בטא 2,3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) התגלו לאחרונה ככלי מבטיח להבנת הביולוגיה של הלבלב האנושי וכמקור לא ממצה ואולי מותאם אישית יותר לטיפול בהשתלות 4,5,6,7. hPSCs, כולל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs), הם בעלי יכולת התחדשות עצמית גבוהה ומעוררים כל סוג רקמה של גוף האדם. hESCs מופקים ממסת התא הפנימית של העובר, ו- hiPSCs מתוכנתים מחדש מכל תא סומטי 4,8.
פרוטוקולי התמיינות מכוונים ממוטבים ליצירת תאי בטא בלבלב מ-hPSCs המכוונים ברצף hPSCs דרך שלבי התפתחות הלבלב. פרוטוקולים אלה מייצרים אורגנואידים של איון שמקורם ב-hPSC. בעוד שהם השתפרו מאוד בהגדלת חלקם של תאי בטא בלבלב בהם, היעילות של פרוטוקולים משתנה מאוד. זה לא עולה ליותר מ ~ 40% של NKX6.1+/אינסולין+ או C-פפטיד + תאים 5,9,10,11,12,13. עם זאת, תאי הבטא שנוצרו אינם זהים לחלוטין לתאי הבטא האנושיים הבוגרים מבחינת פרופילי השעתוק וחילוף החומרים שלהם ותגובתם לגלוקוז 4,5,14. תאי הבטא שמקורם ב-hPSC חסרים ביטוי גנטי של סמני תאי בטא מרכזיים כגון PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 ו-KCNK3 בהשוואה לאיים5 של בני אדם בוגרים. בנוסף, תאי הבטא שמקורם ב-hPSC הפחיתו את איתות הסידן בתגובה לגלוקוז. הם מזוהמים בתאים הפוליהורמונליים שנוצרו במשותף שאינם מפרישים כמויות מתאימות של אינסולין בתגובה להעלאת רמות הגלוקוז5. מצד שני, אבות לבלב שמקורם ב-hPSC, שהם מבשרי איונים, יכולים להיווצר בצורה יעילה יותר במבחנה בהשוואה לתאי בטא, וכאשר הם מושתלים ב-vivo, הם יכולים להבשיל לתאי בטא מתפקדים המפרישים אינסולין15,16. ניסויים קליניים מתמקדים כיום בהוכחת בטיחותם ויעילותם בעת השתלה בנבדקי T1D.
יש לציין כי ביטוי של גורמי השעתוק PDX1 (הומיאובוקס של הלבלב ותריסריון 1) ו- NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) בתוך אותו תא אב בלבלב הוא חיוני למחויבות כלפי שושלת תאי בטא5. אבות לבלב שאינם מצליחים לבטא את NKX6.1 מולידים תאים אנדוקריניים פוליהורמונליים או תאי בטא לא מתפקדים17,18. לכן, ביטוי משותף גבוה של PDX1 ו- NKX6.1 בשלב האב של הלבלב חיוני ליצירת מספר רב של תאי בטא פונקציונליים. מחקרים הראו כי גוף עוברי או תרבית תלת-ממדית משפרים את PDX1 ו-NKX6.1 אצל אבות לבלב שבהם התאים המתמיינים מצטברים, ונעים בין 40%-80% מאוכלוסיית PDX1+/NKX6.1+12,19. עם זאת, בהשוואה לתרביות השעיה, תרביות התמיינות דו-ממדיות הן חסכוניות יותר, ישימות ונוחות יותר ליישום בקווי תאיםמרובים 5. לאחרונה הראינו שתרביות בידול חד-שכבתי מניבות יותר מ-90% מ-PDX1+/NKX6.1+ המבטא במשותף20,21,22 אבות לבלב שמקורם ב-hPSC. השיטה המדווחת העניקה יכולת שכפול גבוהה לאבות הלבלב שנוצרו ומנעה מפרטי גורל חלופיים כגון שושלת הכבד21. לכן, כאן, פרוטוקול זה מדגים שיטה יעילה ביותר להתמיינות של hPSCs למבשרי תאי בטא בלבלב המבטאים במשותף PDX1 ו- NKX6.1. שיטה זו משתמשת בטכניקה של ניתוק אנדודרם שמקורו ב-hPSC ומניפולציה של צפיפות התא, ולאחר מכן איתות FGF ורטינואידי מורחב, כמו גם עיכוב קיפוד כדי לקדם ביטוי משותף של PDX1 ו-NKX6.1 (איור 1). שיטה זו יכולה להקל על דור מדרגי של מבשרי תאי בטא בלבלב שמקורם ב-hPSC לטיפול בהשתלות ומידול מחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת פרוטוקול משופר ליצירת אבות לבלב מ- hPSCs עם ביטוי משותף גבוה של PDX1 ו- NKX6.1. דיסוציאציה וציפוי מחדש של האנדודרם שמקורו ב-hPSC בחצי צפיפות על מטריצה טרייה הביאו ל-PDX1 ו-NKX6.1 גבוהים יותר באבות לבלב שמקורם ב-hPSC.
למרות שקוקטייל גורם הגדילה עבור כל שלב דומה מאוד ל- P1-ND<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF) (מענק מס’. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
