Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Diabetes ist eine komplexe Stoffwechselstörung, von der Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Die Supplementierung von Insulin gilt als einzige Behandlungsoption für Diabetes. Fortgeschrittenere Fälle werden mit einer Betazellersatztherapie behandelt, die durch Transplantation entweder der ganzen Kadaver-Bauchspeicheldrüse oder der Inseln^{erreicht wird 1,2}. Mehrere Probleme umgeben die Transplantationstherapie, wie die Einschränkung der Verfügbarkeit und Qualität des Gewebes, die Invasivität von Transplantationsverfahren sowie der kontinuierliche Bedarf an Immunsuppressiva. Dies erfordert die Entdeckung neuer und alternativer Optionen für die Betazellersatztherapie ^2,3. Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) haben sich kürzlich als vielversprechendes Werkzeug für das Verständnis der menschlichen Pankreasbiologie und als nicht erschöpfende und potenziell personalisiertere Quelle für die Transplantationstherapie erwiesen 4,5,6,7. hPS-Zellen, einschließlich humaner embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und human-induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen), haben eine hohe Selbsterneuerungskapazität und führen zu jedem Gewebetyp des menschlichen Körpers. hES-Zellen werden aus der inneren Zellmasse des Embryos abgeleitet, und hiPS-Zellen werden aus jeder somatischen Zelle^{umprogrammiert 4,8}.

Gerichtete Differenzierungsprotokolle sind optimiert, um Betazellen der Bauchspeicheldrüse aus hPS-Zellen zu erzeugen, die hPS-Zellen invitro sequentiell durch pankreas-Entwicklungsstadien leiten. Diese Protokolle erzeugen hPSC-abgeleitete Inselorganoide. Während sie den Anteil der Betazellen der Bauchspeicheldrüse stark verbessert haben, ist die Effizienz der Protokolle sehr variabel. Es steigt nicht auf mehr als ~40% von NKX6.1+/INSULIN+ oder C-PEPTIDE + Zellen 5,9,10,11,12,13. Die erzeugten Betazellen sind jedoch hinsichtlich ihrer transkriptionellen und metabolischen Profile und ihrer Reaktion auf Glukose ^4,5,14 nicht vollständig identisch mit den adulten menschlichen Betazellen. Den hPSC-abgeleiteten Betazellen fehlt die Genexpression von wichtigen Betazellmarkern wie PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 und KCNK3 im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Inseln⁵. Darüber hinaus haben die hPSC-abgeleiteten Betazellen eine verminderte Kalziumsignalisierung als Reaktion auf Glukose. Sie sind mit den kogenerierten polyhormonellen Zellen kontaminiert, die als Reaktion auf steigende Glukosespiegel^keine angemessenen Mengen an Insulin absondern5. Auf der anderen Seite könnten hPSC-abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen, die Inselvorläufer sind, in vitro effizienter erzeugt werden als Betazellen und könnten, wenn sie in vivo transplantiert werden, zu funktionellen, Insulin-sekretierenden Betazellen heranreifen^15,16. Klinische Studien konzentrieren sich derzeit darauf, ihre Sicherheit und Wirksamkeit bei der Transplantation bei T1D-Probanden nachzuweisen.

Insbesondere die Expression der Transkriptionsfaktoren PDX1 (Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1) und NKX6.1 (NKX6 Homöobox 1) innerhalb derselben Pankreas-Vorläuferzelle ist entscheidend für das Engagement für eine Betazelllinie⁵. Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, die NKX6.1 nicht exprimieren, führen zu polyhormonellen endokrinen Zellen oder nicht-funktionellen Betazellen^17,18. Daher ist eine hohe Co-Expression von PDX1 und NKX6.1 im Pankreas-Vorläuferstadium essentiell, um letztendlich eine große Anzahl funktioneller Betazellen zu erzeugen. Studien haben gezeigt, dass ein embryoider Körper oder eine 3D-Kultur PDX1 und NKX6.1 in Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse verstärkt, bei denen die differenzierenden Zellen aggregiert sind, wobei sie zwischen 40% und 80% der PDX1+/NKX6.1+-Population^{variieren 12,19}. Im Vergleich zu Suspensionskulturen sind 2D-Differenzierungskulturen jedoch kostengünstiger, praktikabler und bequemer für die Anwendung auf mehreren Zelllinien⁵. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Monolayer-Differenzierungskulturen mehr als bis zu 90% der PDX1+/NKX6.1+ co-exprimierenden hPSC-abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen^20,21,22 liefern. Die berichtete Methode verlieh den erzeugten Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse eine hohe Replikationskapazität und verhinderte alternative Schicksalsspezifikationen wie die hepatische Linie²¹. Daher demonstriert dieses Protokoll hierin eine hocheffiziente Methode zur Differenzierung von hPSCs zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse, die PDX1 und NKX6.1 koexprimieren. Diese Methode verwendet die Technik der Dissoziation von hPSC-abgeleitetem Endoderm und der Manipulation der Zelldichte, gefolgt von einer erweiterten FGF- und Retinoid-Signalisierung sowie einer Hedgehog-Hemmung, um die PDX1- und NKX6.1-Koexpression zu fördern (Abbildung 1). Diese Methode kann eine skalierbare Generierung von hPSC-abgeleiteten Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse für die Transplantationstherapie und Krankheitsmodellierung ermöglichen.