Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в предшественники бета-клеток поджелудочной железы в системе 2D-культур
Summary
Настоящий протокол описывает усовершенствованный метод увеличения коэкспрессии факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в планарных монослоях. Это достигается путем пополнения свежей матрицы, манипулирования плотностью клеток и диссоциации эндодермальных клеток.
Abstract
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) являются отличным инструментом для изучения раннего развития поджелудочной железы и исследования генетических факторов диабета. Клетки, полученные из hPSC инсулина, могут быть получены для клеточной терапии и моделирования заболеваний, однако, с ограниченной эффективностью и функциональными свойствами. hPSC-производные предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками бета-клеток и других эндокринных клеток, при совместной экспрессии двух факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 указывают предшественников функциональных, инсулин-секретирующих бета-клеток как in vitro , так и in vivo. Предшественники поджелудочной железы, полученные из hPSC, в настоящее время используются для клеточной терапии у пациентов с диабетом 1 типа в рамках клинических испытаний. Однако современные процедуры не генерируют высокую долю NKX6.1 и предшественников поджелудочной железы, что приводит к когенерации нефункциональных эндокринных клеток и нескольких чувствительных к глюкозе, инсулин-секретирующих клеток. Таким образом, эта работа разработала расширенный протокол для генерации прародителей поджелудочной железы, полученных из hPSC, которые максимизируют совместную экспрессию PDX1 и NKX6.1 в 2D-монослое. Такие факторы, как плотность клеток, наличие свежей матрицы и диссоциация эндодермальных клеток, полученных из hPSC, модулируются, что увеличивает уровни PDX1 и NKX6.1 в генерируемых предшественниках поджелудочной железы и сводит к минимуму приверженность альтернативной печеночной линии. Исследование подчеркивает, что манипулирование физической средой клетки во время дифференцировки in vitro может повлиять на спецификацию родословной и экспрессию генов. Таким образом, текущий оптимизированный протокол облегчает масштабируемую генерацию коэкспрессионных предшественников PDX1 и NKX6.1 для клеточной терапии и моделирования заболеваний.
Introduction
Диабет является сложным метаболическим расстройством, затрагивающим миллионы людей во всем мире. Добавление инсулина считается единственным вариантом лечения диабета. Более продвинутые случаи лечатся бета-клеточной заместительной терапией, достигаемой путем трансплантации либо целой трупной поджелудочной железы, либо островков 1,2. Несколько вопросов связаны с трансплантационной терапией, такие как ограничение доступности и качества ткани, инвазивность процедур трансплантации в дополнение к постоянной потребности в иммунодепрессантах. Это обусловливает необходимость открытия новых и альтернативных вариантов бета-клеточной заместительной терапии 2,3. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) недавно стали многообещающим инструментом для понимания биологии поджелудочной железы человека и неисчерпывающим и потенциально более персонализированным источником для трансплантационной терапии 4,5,6,7. hPSCs, включая человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), обладают высокой способностью к самообновлению и дают начало любому типу тканей человеческого тела. hESCs получают из внутренней клеточной массы эмбриона, а hiPSCs перепрограммируются из любой соматической клетки 4,8.
Протоколы направленной дифференцировки оптимизированы для генерации бета-клеток поджелудочной железы из hPSCs, которые последовательно направляют hPSCs через стадии развития поджелудочной железы invitro. Эти протоколы генерируют островковые органоиды, полученные из hPSC. Хотя они значительно улучшились в увеличении доли бета-клеток поджелудочной железы в них, эффективность протоколов сильно варьируется. Он не увеличивается до более чем ~40% NKX6.1+/INSULIN+ или C-PEPTIDE + клеток 5,9,10,11,12,13. Однако генерируемые бета-клетки не полностью идентичны бета-клеткам взрослого человека с точки зрения их транскрипционных и метаболических профилей и их реакции на глюкозу 4,5,14. Бета-клеткам, полученным из hPSC, отсутствует экспрессия генов ключевых маркеров бета-клеток, таких как PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 и KCNK3 по сравнению с островками5 взрослых людей. Кроме того, бета-клетки, полученные из hPSC, уменьшают передачу сигналов кальция в ответ на глюкозу. Они загрязнены совместно генерируемыми полигормональными клетками, которые не секретируют соответствующее количество инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы5. С другой стороны, производные от hPSC предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками островков, могут генерироваться более эффективно in vitro по сравнению с бета-клетками и при трансплантации in vivo могут созревать в функциональные, секретирующие инсулин бета-клетки15,16. Клинические испытания в настоящее время сосредоточены на демонстрации их безопасности и эффективности при трансплантации у субъектов СД1.
Примечательно, что экспрессия транскрипционных факторов PDX1 (панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1) и NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) в пределах одной и той же клетки-предшественника поджелудочной железы имеет решающее значение для приверженности бета-клеточной линии5. Предшественники поджелудочной железы, которые не экспрессируют NKX6.1, дают начало полигормональным эндокринным клеткам или нефункциональным бета-клеткам17,18. Таким образом, высокая коэкспрессия PDX1 и NKX6.1 на стадии предшественника поджелудочной железы необходима для получения в конечном итоге большого количества функциональных бета-клеток. Исследования показали, что эмбриоидное тело или 3D-культура усиливает PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, где дифференцирующие клетки агрегируются, варьируясь между 40%-80% PDX1 + / NKX6.1 + популяции12,19. Однако, по сравнению с культурами суспензии, культуры 2D-дифференцировки являются более экономически эффективными, осуществимыми и удобными для применения на нескольких клеточных линиях5. Недавно мы показали, что монослойные дифференцировочные культуры дают более 90% PDX1+/NKX6.1+, коэкспрессирующих hPSC-производных предшественников поджелудочной железы 20,21,22. Сообщенный способ придавал высокую реплицирующую способность генерируемым прародителям поджелудочной железы и предотвращал альтернативные спецификации судьбы, такие как печеночная линия21. Таким образом, в настоящем описании данный протокол демонстрирует высокоэффективный способ дифференцировки гПСК к предшественникам бета-клеток поджелудочной железы, совместно экспрессирующим PDX1 и NKX6.1. Этот метод использует технику диссоциации эндодермы, полученной из hPSC, и манипулирования плотностью клеток с последующей расширенной передачей сигналов FGF и ретиноидов, а также ингибированием Hedgehog для стимулирования коэкспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 1). Этот метод может способствовать масштабируемой генерации прекурсоров бета-клеток поджелудочной железы, полученных из hPSC, для трансплантационной терапии и моделирования заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе описан усовершенствованный протокол генерации предшественников поджелудочной железы из гПСК с высокой коэкспрессией PDX1 и NKX6.1. Диссоциация и повторное покрытие эндодермы, полученной из hPSC, при половинной плотности на свежей матрице привели к повышению PDX1 и NKX6.1 у предше…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No. НПРП10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
