Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D
Summary
El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.
Abstract
Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) son una excelente herramienta para estudiar el desarrollo pancreático temprano e investigar los contribuyentes genéticos a la diabetes. Sin embargo, las células secretoras de insulina derivadas de hPSC se pueden generar para la terapia celular y el modelado de enfermedades, con una eficiencia y propiedades funcionales limitadas. Los progenitores pancreáticos derivados de hPSC que son precursores de las células beta y otras células endocrinas, cuando coexpresan los dos factores de transcripción PDX1 y NKX6.1, especifican los progenitores de las células beta funcionales secretoras de insulina tanto in vitro como in vivo. Los progenitores pancreáticos derivados de hPSC se utilizan actualmente para la terapia celular en pacientes con diabetes tipo 1 como parte de ensayos clínicos. Sin embargo, los procedimientos actuales no generan una alta proporción de NKX6.1 y progenitores pancreáticos, lo que lleva a la cogeneración de células endocrinas no funcionales y pocas células secretoras de insulina sensibles a la glucosa. Este trabajo desarrolló un protocolo mejorado para generar progenitores pancreáticos derivados de hPSC que maximizan la coexpresión de PDX1 y NKX6.1 en una monocapa 2D. Los factores como la densidad celular, la disponibilidad de matriz fresca y la disociación de las células endodérmicas derivadas de hPSC se modulan para aumentar los niveles de PDX1 y NKX6.1 en los progenitores pancreáticos generados y minimizar el compromiso con el linaje hepático alternativo. El estudio destaca que la manipulación del entorno físico de la célula durante la diferenciación in vitro puede afectar la especificación del linaje y la expresión génica. Por lo tanto, el protocolo optimizado actual facilita la generación escalable de progenitores coexpresivos PDX1 y NKX6.1 para la terapia celular y el modelado de enfermedades.
Introduction
La diabetes es un trastorno metabólico complejo que afecta a millones de personas en todo el mundo. La suplementación de insulina se considera la única opción de tratamiento para la diabetes. Los casos más avanzados se tratan con terapia de reemplazo de células beta, lograda mediante el trasplante de páncreas cadavérico completo o islotes 1,2. Varios problemas rodean la terapia de trasplante, como la limitación con la disponibilidad y calidad del tejido, la invasividad de los procedimientos de trasplante, además de la necesidad continua de inmunosupresores. Esto requiere la necesidad de descubrir opciones novedosas y alternativas para la terapia de reemplazo de células beta 2,3. Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) han surgido recientemente como una herramienta prometedora para comprender la biología del páncreas humano y como una fuente no exhaustiva y potencialmente más personalizada para la terapia de trasplante 4,5,6,7. Las hPSC, incluidas las células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs), tienen una alta capacidad de autorrenovación y dan lugar a cualquier tipo de tejido del cuerpo humano. Las hESCs se derivan de la masa celular interna del embrión, y las hiPSCs se reprograman a partir de cualquier célula somática 4,8.
Los protocolos de diferenciación dirigida están optimizados para generar células beta pancreáticas a partir de hPSCs que dirigen secuencialmente hPSCs a través de etapas de desarrollo pancreático invitro. Estos protocolos generan organoides de islotes derivados de hPSC. Si bien han mejorado mucho en el aumento de la proporción de células beta pancreáticas en ellos, la eficiencia de los protocolos es muy variable. No aumenta a más de ~40% de las células NKX6.1+/INSULINA+ o C-PÉPTIDO + 5,9,10,11,12,13. Sin embargo, las células beta generadas no son completamente idénticas a las células beta humanas adultas en términos de sus perfiles transcripcionales y metabólicos y su respuesta a la glucosa 4,5,14. Las células beta derivadas de hPSC carecen de expresión génica de marcadores clave de células beta como PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 y KCNK3 en comparación con losislotes 5 de humanos adultos. Además, las células beta derivadas de hPSC han disminuido la señalización de calcio en respuesta a la glucosa. Están contaminados con las células polihormonales cogeneradas que no secretan cantidades adecuadas de insulina en respuesta al aumento de los niveles de glucosa5. Por otro lado, los progenitores pancreáticos derivados de hPSC, que son precursores de islotes, podrían generarse de manera más eficiente in vitro en comparación con las células beta y, cuando se trasplantan in vivo, podrían madurar en células beta funcionales, secretoras de insulina15,16. Los ensayos clínicos se centran actualmente en demostrar su seguridad y eficacia tras el trasplante en sujetos con DT1.
En particular, la expresión de los factores de transcripción PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) y NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) dentro de la misma célula progenitora pancreática es crucial para el compromiso hacia un linaje de células beta5. Los progenitores pancreáticos que no expresan NKX6.1 dan lugar a células endocrinas polihormonales o células beta no funcionales17,18. Por lo tanto, una alta coexpresión de PDX1 y NKX6.1 en la etapa progenitora pancreática es esencial para generar finalmente un gran número de células beta funcionales. Los estudios han demostrado que un cuerpo embrioide o cultivo 3D mejora PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos donde se agregan las células diferenciadoras, variando entre el 40% -80% de la población PDX1+/NKX6.1+12,19. Sin embargo, en comparación con los cultivos en suspensión, los cultivos de diferenciación 2D son más rentables, factibles y convenientes para su aplicación en múltiples líneas celulares5. Recientemente hemos demostrado que los cultivos de diferenciación monocapa producen más del 90% de los progenitores pancreáticos derivados de hPSC que coexpresan PDX1+/NKX6.1+20,21,22. El método reportado confirió una alta capacidad de replicación a los progenitores pancreáticos generados y evitó especificaciones de destino alternativo como el linaje hepático21. Por lo tanto, en este documento, este protocolo demuestra un método altamente eficiente para la diferenciación de hPSCs a precursores de células beta pancreáticas que coexpresan PDX1 y NKX6.1. Este método utiliza la técnica de disociar el endodermo derivado de hPSC y manipular la densidad celular, seguido de una señalización extendida de FGF y retinoide, así como la inhibición de Hedgehog para promover la coexpresión de PDX1 y NKX6.1 (Figura 1). Este método puede facilitar una generación escalable de precursores de células beta pancreáticas derivadas de hPSC para la terapia de trasplante y el modelado de enfermedades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe un protocolo mejorado para generar progenitores pancreáticos a partir de hPSCs con una alta coexpresión de PDX1 y NKX6.1. La disociación y el replacado del endodermo derivado de hPSC a la mitad de la densidad en la matriz fresca dieron lugar a mayores PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de hPSC.
Aunque el cóctel del factor de crecimiento para cada etapa es muy similar a P1-ND 27, se ha demostrado que un tratamiento más extendido de la Etapa 3 que in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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