ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

1. 必要な資料を用意する 注:これらの準備は、数日または数週間前に行うのが最善です。 注射針を用意する。注:針は、覆われた容器に無期限に保管することができます。針は、ビテリン膜を突き刺すのに十分な強度でありながら、〜700fLを供給するのに十分なほど細かくなければならない。 ニードルプーラーのキャピラリーホルダーにキャピラリーを置きます。毛細血管をウィングナットで固定します。毛細血管の中心を発熱体に合わせ、2本の対称な針が生成されるようにします。 ニードルプーラーの適切な設定は、製造元の指示に従って選択します。 解剖スコープを使用して品質管理を実行します。メモ: 針先はできるだけ細かくする必要があります。ひび割れ、ギザギザ、または大口径の針先は廃棄されます。 一度に10本の針(5本の毛細血管分)のバッチを準備します。 シリンダーに巻き上げられた変形可能なパテを、蓋付きの容器の底の中央に置きます。損傷を防ぐために、針先を安全に空気中に吊り下げて水平に保持するように、針をパテに慎重に押し込みます。蓋で覆い、使用時まで保管してください。 採卵プレートを用意する。4°Cで保存してください。注:採卵プレートは、産卵を促進するためにフルーツジュースを補充した小さな寒天プレートです。それらを準備する方法は、13を含む多くのプロトコルで説明されています。 ヘプタン接着剤を準備します。注:この接着剤は両面テープから抽出され、胚をカバースリップにしっかりと取り付けるために使用されます。これは、注射およびイメージング中に胚が焦点から外れて浮遊するのを防ぎます。接着剤は数日または数週間前に準備することができます。 両面テープをゴルフボールよりも大きなサイズにボールアップし、しっかりと密閉された蓋付きの〜50mLのガラス容器の底に置きます。十分な接着剤が存在するようにテープをしっかりとパックします。 ヒュームフードで、ガラス容器にヘプタンを入れてすべてのテープを覆います。使用しないときは容器をしっかりと閉めてください。警告: ヘプタンは液体および蒸気として可燃性です。それは目、皮膚、および気道の刺激を引き起こす可能性があります。呼吸蒸気は眠気、めまい、肺の損傷を引き起こす可能性があります。ヘプタンを発火源から遠ざけ、可燃物用の換気の良い場所に保管し、互換性のない物質から遠ざけてください。 ヘプタン接着剤を一晩以上座らせてください。最良の結果を得るには、容器をシェーカーまたは他の攪拌機に一晩置いて、接着剤の溶解に役立ててください。注:テープ自体は残りますが、接着剤はヘプタンに溶解されます。ステップ5.1.2では、接着剤をカバースリップに適用します。ヘプタンは蒸発し、接着剤を残します。 ヘプタン接着剤調製物をスライドガラス上に一滴置き、ヘプタンが蒸発した後に粘着性の残留物が残っていることを確認することによって試験する。後で糊残りが見えない場合は、ガラス容器にテープを追加して、前の手順を繰り返します。注:一度準備すると、接着剤は数ヶ月または数年使用することができます。 市販品を得た調製物を純粋な無水DMSOで希釈することにより、1mg/mL(3.8mM)BODIPY493/503ストック溶液を調製する。光や水から保護するために、それを覆ったままにしておいてください。-20°Cで無期限に、または4°Cで短期間保管してください。 2.採卵ケージを用意する 注:計画された注射の少なくとも1日前(好ましくは2〜3日前)にこれを行います。 酵母ペーストを調製する。注:酵母ペーストは、リンゴジュースプレートにないタンパク質やその他の重要な栄養素を補います。それは産卵と産卵を促進します。 乾燥パン酵母2〜10gを加え、次いで1mLの水道水を小さなビーカーに加える。ヘラを使って混ぜる。 水道水を1 mL刻みで、希望の歯磨き粉のような粘稠度に達するまで加え続けます。 混合物を覆い、4°Cで保存する。 卵収集用のフライケージを設置する。注:所望の遺伝子型の雄および雌のハエが必要である:生後2週間未満の10〜50匹の雌および同数の雄。フライケージには、自家製オプション14,13など、さまざまなオプションがあります。リンゴジュースプレートのサイズがフライケージのサイズと一致することが重要です。 リンゴジュースプレートの上に酵母ペーストの小さな塗抹標本を置きます。寒すぎるとハエが皿に卵を産まないので、それを覆って室温にしてください。 ハエを胚採取ケージに移し、酵母リンゴジュースプレートで密封し、プレートを胚採取ケージに固定する。 新しく移されたハエがケージに1〜2日間順応するのを許し、プレートを毎日新鮮なものと交換する。翌日までにすべての酵母が食べられた場合は、将来のコレクションのために酵母ペーストの量を増やしてください。注:これは、十分に給餌された雌がより多くの卵を産むにつれて、卵収量を増加させるための重要なステップです。 3.注射当日、注射液を調製し、針に装填する BODIPY 493/503(DMSOでは3.8mM)の原液を注射液として使用します。 針ローディングチップを使用して、1本の針に1μLの注射液をロードします。メモ:気泡を閉じ込めることなく、液体を先端まで届けるように努力してください。誤って破損した場合に備えて、装填された針をすばやく交換する準備をしてください。 ローディングチップをマイクロピペットに取り付け、1 μLの注射液をチップに引き込む。手袋を使用して、針を片手で持ち、先端を離して破損のリスクを最小限に抑えます。 ローディングチップを針に慎重に挿入し、針先の近くに押し込みます。針先の近くに液体を分配します。ピペットを取り外した後、液体が先端に流れるまで針を先端に下げて垂直に保持します。 ロードされた針を上記のようにパテの入った別の容器に保管します(ステップ1.1.5を参照)。注:針は事前に(最大数時間)注射を準備する必要がありますが、1日以上後に使用しないでください。 染料の漂白を防ぐために、針を周囲光から遠ざけてください。針先を傷つけずに保管容器をアルミホイルで覆います。すべてのライトが不明瞭になっていることを確認します。 4. 注射用胚の採取 注:収集のタイミングは、注射を行う必要がある胚のどの段階で行う必要があるかによって異なります。以下のタイミングスキームにより、注射の準備時の胚は0〜90分齢となり、これは卵割段階15に相当する。 注射の日に、ステップ2.2.1のように、酵母でリンゴジュースプレートを準備します。Nラウンドの注射が計画されている場合は、N + 2プレートを準備します。これらのプレートを室温に保ちます。注:注射用の胚を採取するためのNプレートに加えて、1つのプレートが収集前プレートとして必要であり、収集が完了するとケージ内のハエに餌を供給するためのもう1つのプレートが必要である。 ケージのプレートを新鮮な酵母プレート(プレコレクションプレート)と交換し、ケージに1〜2時間放置します。 ケージのプレートを新しいプレート(収集プレート)と交換してください。事前収集プレートは、所望よりも古い胚を含むため、廃棄する。その後、ハエが1.5時間卵を産むのを許します。注:よく給餌されたハエは通常、卵が受精した直後に卵を産むので、1.5時間の収集時間は、収集の終わりに、プレート上の胚のほとんどが0〜90分齢である、すなわち、切断段階にあることを保証する。前日から新鮮な酵母を与えられていない雌のハエは、産卵前に不確定な時間受精卵を保持する傾向があります。したがって、収集前プレートには、収集開始前に受精した胚があり、したがって60分より古く、時にははるかに古い胚がある。 ケージのプレートを新鮮な酵母プレートと交換します。迷子のハエが卵を産まないように収集プレートを覆う。 5. マイクロインジェクション用の胚を準備する 必要な材料を組み立てます。 両面テープをスライドガラスに貼り付けます。指でテープに触れると粘着性が低下するため、テープに触れないでください。注:このスライドは、画像ではなく、絨毛膜を除去するために使用します。 トランスファーピペットまたはマイクロピペット (p200 または p1000) を使用して、長方形のカバースリップ (60 x 25 mm) のほぼ中央にヘプタン接着剤の小さな滴 (200 μL 以下) を置きます。ヘプタンが蒸発するのを許します(これは1分もかかりません)。注:このカバースリップは、注射およびイメージングのために胚をマウントするために使用されます。寸法は、共焦点顕微鏡の調整可能な金属ホルダーに収まるように選択されます。 乾燥チャンバと、乾燥ビーズを含む密閉チャンバ(例えば、タッパーウェアサンドイッチボックス)とを組み立てる。水和していない乾燥ビーズのみを使用してください。注:胚が注射液を摂取するようにするには、胚をわずかに乾燥させて内圧を下げる必要があります。これは、脱絨毛された空気暴露胚を含むカバースリップを乾燥チャンバに入れることによって行われる。 機械的に絨毛膜を除去する。 適切に老化した胚板をハロカーボンオイル27の薄層で覆い、卵殻を透明にする。注:胚は数十秒以内に半透明になります15。この工程が効率的に行われない場合、リンゴジュースプレートが濡れすぎている可能性があり、使用前に乾燥させる必要があります。 胚の段階を確認するために、トランスイルミネーション(すなわち、プレートを通って接眼レンズに入る光)で解剖スコープの下でプレートを見る。 卵割段階の胚を選択する。注:切断段階の胚は完全に不透明です。その後の胚盤葉段階は、不透明な中心15の周囲全域の透明な細胞質のバンドによって認識することができる。さまざまな胚期を認識する方法に関する良い紹介は、発生生物学会が管理するウェブサイト(参考文献16で与えられています)で入手できます。 細かいピンセットを使用して、その背側付属器によって所望の段階の胚をつかみ、両面テープで覆われた準備されたスライドガラス上に移す。胚をテープの上に置きます。オイルの移動を最小限に抑えます。 できるだけ穏やかに、ピンセットの先端の側面で胚を優しくなでることによって、テープの表面を横切って胚を転がす。鋭いピンセットの先端で胚を直接突かないでください。注:加えられた力が小さすぎると、胚は転がりません。高すぎると破裂します。適切な中間力を見つけるには経験が必要であり、したがって、このステップは事前に実践されるべきです。 絨毛膜がテープに一過性に付着して亀裂が入るまで胚を転がし続けます。 絨毛膜がひび割れたら、絨毛膜がテープにくっついたままなので、胚(まだビテリン膜の内側)を絨毛膜から分離するために転がり続けます。 胚からの背側付属器の喪失を観察することによって、絨毛膜が完全に除去されていることを確認する。 胚をテープよりも接着性の低い絨毛膜の上にロールバックします。胚をピンセットで優しくこすり、ピンセットに付着させて転写します。 ヘプタン接着剤で胚をカバースリップに移し、接着剤と接触させると、通常はピンセットから剥離する。 カバースリップ上の胚の向きを調整します。 胚の側面を接着剤に埋め込む。注:接着剤に埋め込まれた胚の表面は、画像化されるものです。側面を埋め込むのが最も簡単ですが、これは個人的な好みや答えるべき生物学的質問に応じて調整できます。 胚の長軸をカバースリップの長軸に垂直に向ける。 胚が好ましい向きにならない場合は、ピンセットをきれいにして、胚を接着剤から剥離する油を取り除きます。次に、胚を所定の位置に静かに転がしてみます。 上記の方法で注射用の所望の数の胚を準備する。注:絨毛膜を除去してから時間が経つにつれて、周囲の空気が胚を乾燥させ始めるため、ステップ5.3の効果は、異なる時間に脱絨毛されたカバースリップ上の胚にとって不均一になる。典型的には、1〜3個の胚が最も管理しやすい。 胚を乾燥させる。 胚の入ったカバースリップを準備された乾燥室に入れ、密封する。 胚を5〜12分間乾燥させる。メモ:このステップのタイミングは周囲温度と湿度に依存するため、経験的に決定する必要があります。 カバースリップをチャンバーから取り外し、その上にハロカーボンオイル700を一滴置き、胚を完全に覆い、さらなる乾燥を防ぎます。 解剖スコープで胚を検査し、適切な乾燥を判断します。 胚がわずかに縮んでいるが収縮していない場合は、マイクロインジェクションに進みます(ステップ6)。 胚が十分に乾燥していないか、または過度に乾燥されていない場合は、ステップ5.2に戻り、ハロカーボンオイル700を除去することができないため、新しい胚のバッチを準備します。胚が過度に乾燥された場合は、次のバッチの胚の乾燥時間を3分短縮する。乾燥が不十分な場合は、乾燥時間を 3 分長くします。 6. マイクロインジェクション胚 メモ:マイクロインジェクションのセットアップに、倒立顕微鏡、注射針を保持して位置決めするためのマイクロマニピュレータ、および制御されたボリュームを供給するための市販のマイクロインジェクタが含まれていることを確認してください。 マイクロインジェクタの電源を入れ、お好みの設定を入力します。メモ:このプロトコルでは、リニアモーション出力と高速設定を使用することをお勧めしますが、他の多くのプロトコルでも動作します。オペレーターは、個人的な好みを決定する必要があります。 マイクロマニピュレータに針をロードします。胚を含むカバースリップを装填中に針が損傷するのを防ぐために、針を邪魔にならないように安全な位置に動かしてください。 カバースリップをステージの上に置き、胚を上にして針に向かって置きます。次に、針を注射用の位置に慎重に戻し、先端をステージのかなり上に戻します。 4x 対物レンズをライト パスに配置します。顕微鏡のフォーカスノブを使用して、胚に焦点を合わせます。注:これは注入に使用される焦点面であり、今後は最小限に抑えられます。 ステージコントロールを使用して、胚を視野の中心に水平に移動します。 胚から離れてパンし、針を下げる準備をして、視野の端に保ちます。針が正しい位置に下がっていることを確認するために、同じ焦点面にとどまります。 針先を正しい焦点面に下ろし、胚と一緒に視野に見えるようにします。 マイクロマニピュレータコントロールを使用し、上から(まだ接眼レンズを通していない)見て、針先をゆっくりとオイルに落とし、目標が指す領域を目指します。オイルは非常に粘性があるので、針を傷つけないようにゆっくりと進んでください。 針が接眼レンズを通して見えるようになったら、針先が焦点が合って視野の中心になるまで、マイクロマニピュレータコントロールを使用し続けます。 ステージを動かすことで、胚を視野の中心に戻します。ステージコントロール、マイクロマニピュレータコントロール、フォーカスノブを使用して、胚と針先が互いに焦点を合わせている間に位置を微調整します。できるだけカバースリップの近くで注射を行うようにしてください。 針の品質管理を行います。 針が機能していることを確認するために、注射液の一部を胚を囲むハロカーボンオイル700に分配し、オイル中の気泡として見える。 針から何も流れていない場合は、インジェクターの圧力を徐々に上げます。これでうまくいかない場合は、新しい針を入手してください。 胚を注入する。注:許容可能な注入量は〜0.06〜1 pLの範囲です。下限は、胚に入ることを可視化できるものによって設定される。上限は、注射が胚に及ぼす外傷によって設定される。 これは最も侵襲的ではないので、胚の側面縁に沿って注入する。 ステージコントロールを使用して、胚が胚を優しく穿刺して入るまで、胚を針先に向かって動かします。 同時に、注射液の流れを開始し、胚への液体の移入が成功したことを示す針先の部位に一過性の透明な斑点が現れるのを観察する。 胚を監視する。胚が針に抵抗し、侵入時に破裂(細胞質が噴き出す)場合は、ステップ5に戻り、乾燥時間を増やします。胚がカバースリップに対して平らで、注射中にフロッピーに見える場合は、ステップ5に戻り、乾燥時間を短縮します。 胚に色素が入っていない場合は、手順6.7のように色素が針から自由に流れることを確認します。染料が流れない場合は、針を交換してください。色素が流れたら、新しい胚を注入し、針が胚を穿刺する直前に色素の放出を開始します。注:同じ胚の反復注射は、以前の創傷/注射部位を破裂させるため、推奨されません。 すべての胚が注入されるまで繰り返す。 7. 画像胚 注:このプロトコルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡を利用しています。 共焦点顕微鏡の金属ホルダーにカバースリップを入れて、胚がカバースリップを通して下から直接画像化されるようにする。カバースリップの上には、オイルのみがあり、他の障壁はありません。 品質管理ステップとして、まず共焦点顕微鏡上の落射蛍光機能を用いて、40倍の対物レンズを用いた画像。続行する前に、蛍光色素分子が胚に見えることを確認してください。 所望のイメージング面が注射部位と異なる場合、色素が標的領域に拡散するのに十分な時間を与える。注: BOPIPY 493/503 の場合、この時間は通常 30 ~ 60 分の範囲です。拡散時間は色素に大きく依存するため、他の色素は注射部位の最適化や待ち時間が必要な場合があります。 異なるスケールでのイメージングには、異なる対物レンズを使用します。40倍の対物レンズを使用してすべての胚を画像化し、63倍の対物レンズを使用して、より小さなスケールのサブセクションを画像化します。 細胞化前の同期段階のライブイメージングでは、まず、画像サイズが512 x 512ピクセル、ライン平均が3、フレームレートが毎秒0.1フレーム(つまり、10秒ごとに1フレーム取得)の条件を使用します。使用する顕微鏡の能力に応じて条件を調整します。注:これらの条件により、BOPIPY 493/503から約500以上の画像を取得し、ほとんどの動きをキャプチャできます。 8. 最初にフィジーを使用して画像の時系列を準備し、次にPIV分析のためにPythonを使用してLDフローを分析します 画像取得を最適化します。 適切な段階で所望の色素の注射を行う。日々の変動が無視できる程度になるまで、この手順を繰り返します。 倍率、ズーム、解像度、フレームレートなどの画像取得設定を最適化します。メモ:高品質の画像(解像度+ライン平均化)と集録速度(フレームレート)の間にはトレードオフがあります。 フィジーでデータを準備します。 分析する高品質の時系列を取得します。 時系列の1つのフレームを開き、FIJIでマスクを生成します。画像を複製します。イメージの Type を 8 ビットに変換します。 ポリゴンまたはフリーハンド選択ツールを使用して胚の境界を定義します。「外側を消去」を使用して、選択範囲の外側のピクセル値を 0 に設定します。選択範囲内をクリアしてから反転すると、選択範囲内のピクセルの値が最大値 (255) に設定されます。 選択を解除し、[ ヒストグラム] コマンドを使用して、0 と 255 のピクセル値のみが存在することを確認します。 この新しいイメージマスクを特定の時系列に保存します。 対象の時系列を開きます。関心のある時間を最もよく捉える10フレーム、例えば皮質収縮の開始時の核サイクル9を選択します。目的の 10 フレームを複製し、サブスタックを形成します。 画像 へのスタック 機能を使って、PIVで分析する10個の画像を生成します。 個々のファイルを順序 (SeriesX_1、SeriesX_2、SeriesX_3など) で保存します。 PIV分析には、用意されたサンプルPythonスクリプト(補足データ)またはユーザーが生成したカスタムスクリプトを使用して、準備されたマスクと個々のフレームを使用します。注: 提供されているスクリプトは OpenPIV17 の Python アプリケーションに基づいています。距離をピクセル単位で出力し、ピクセル幅とフレームレートを使用して変換して速度や速度を生成します。 追加の胚について前の手順を完了し、出力値をコンパイルして、複製を生成します。