Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles
Summary
Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.
Abstract
Les embryons précoces de drosophiles sont de grandes cellules contenant une vaste gamme d’organites conventionnels et spécifiques à l’embryon. Au cours des trois premières heures de l’embryogenèse, ces organites subissent des mouvements spectaculaires alimentés par le flux cytoplasmique à base d’actine et le trafic motorisé le long des microtubules. Le développement d’une multitude de petites sondes fluorescentes spécifiques aux organites (PF) permet de visualiser un large éventail de structures lipidiques différentes dans n’importe quel génotype, permettant une imagerie en direct sans nécessiter de fluorophore génétiquement codé. Ce protocole montre comment injecter des colorants vitaux et des sondes moléculaires dans des embryons de drosophiles pour surveiller le trafic d’organites spécifiques par imagerie vivante. Cette approche est démontrée par le marquage des gouttelettes lipidiques (LD) et en suivant leur mouvement en vrac par vélocimétrie par image particulaire (PIV). Ce protocole fournit une stratégie propice à l’étude d’autres organites, y compris les lysosomes, les mitochondries, les vésicules vitellins et les RE, et pour suivre le mouvement des TA individuelles le long des microtubules. L’utilisation de colorants disponibles dans le commerce apporte les avantages de la séparation dans les régions violette/bleue et rouge lointain du spectre. Par co-marquage multiplex des organites et/ou des éléments du cytosquelette par micro-injection, toutes les ressources génétiques de la drosophile sont disponibles pour des études de trafic sans qu’il soit nécessaire d’introduire des protéines marquées par fluorescence. Contrairement aux fluorophores génétiquement codés, qui ont de faibles rendements quantiques et blanchissent facilement, de nombreux colorants disponibles permettent la capture rapide et simultanée de plusieurs canaux avec des rendements élevés en photons.
Introduction
Les colorants vitaux et les sondes moléculaires sont des outils puissants pour imager des structures cellulaires spécifiques et des organites en direct. Dans l’embryon de drosophile, de nombreux organites différents présentent une localisation induite par le cytosquelette 1,2,3,4, mais l’application de ces petites molécules est difficile car la coquille de l’œuf est imperméable à beaucoup d’entre eux. Ce protocole décrit une méthode d’utilisation de sondes fluorescentes (PF) dans des embryons vivants par microinjection afin de détecter le trafic à grande échelle d’organites. La procédure couvre la préparation de la solution injectable, la collecte d’ovules et la préparation d’embryons, la micro-injection, l’imagerie et l’analyse d’images.
Les réarrangements spatiaux spectaculaires des organites sont courants dans de nombreux ovocytes, œufs et embryons animaux, en partie à cause de la grande taille de ces cellules. Chez l’embryon de drosophile , par exemple, les gouttelettes lipidiques (LD) et les vésicules vitellins se déplacent vers le centre embryonnaire juste avant la cellularisation5. Ce mouvement dépend des microtubules et laisse une région d’environ 40 μm tout autour de la périphérie de l’embryon appauvri des deux organites. Au cours des premiers stades de clivage, de nombreux organites sont transportés par des flux cytoplasmiques entraînés par des contractions à base d’actine-myosine à la surface de l’embryon6. Bien que les embryons de nombreuses espèces présentent des réarrangements similaires, l’embryon de drosophile est particulièrement adapté pour suivre ces processus par imagerie car il se développe à l’extérieur à la « température ambiante » standard du laboratoire, est relativement transparent, assez petit pour s’adapter à la plupart des configurations de microscope et peut être manipulé à l’aide d’outils génétiques puissants.
Pour certains organites, il existe des protéines marquées par fluorescence qui marquent spécifiquement ces structures. Par exemple, le LSD-2 (également connu sous le nom de dPLIN2) est une protéine qui, dans les embryons, cible spécifiquement les LD7. Il existe des lignées de mouches porteuses de transgènes inductibles codant pour une fusion entre la protéine fluorescente verte (GFP) et le LSD-28 ou un piège génétique dans lequel la protéine fluorescente jaune (YFP) est insérée dans la région codante du gène endogène LSD-2 9,10. Cependant, cette approche a des limites, notamment le fait que ces protéines de fusion ont de faibles rendements quantiques et ont tendance à blanchir facilement. En outre, l’étiquetage simultané de plusieurs structures différentes peut être difficile: pour de nombreux organites, un seul type d’étiquette fluorescente (souvent GFP ou mCherry) est actuellement disponible, de sorte que l’imagerie de deux organites en même temps peut nécessiter de nouveaux transgènes ou insertions; De plus, même si des étiquettes compatibles sont disponibles, leur introduction dans une seule souche peut nécessiter des croisements fastidieux. Cela rend également l’utilisation des nombreuses ressources génétiques puissantes moins pratique, par exemple, si deux marqueurs organites, un pilote Gal4 et une construction d’ARNi inductible doivent tous être présents dans la même mère.
En principe, ces limites peuvent être surmontées avec l’utilisation de PF, y compris des colorants vitaux (par exemple, LysoTracker pour marquer les lysosomes), des sondes moléculaires (par exemple, siR-tubuline pour marquer les microtubules) et des molécules biologiques marquées par fluorescence (par exemple, C12 BODIPY pour sonder le métabolisme des acides gras11). D’après leur utilisation dans les cellules cultivées, ils sont généralement bien validés en tant qu’outils puissants pour sonder la biologie cellulaire. Les FP sont polyvalents, ont des propriétés photo supérieures et sont compatibles avec les protéines fluorescentes. Plusieurs colorants peuvent être mélangés et appliqués simultanément, souvent avec les avantages de la séparation dans les zones violettes / bleues et rouges lointains du spectre et de petits décalages de Stokes, empêchant le saignement des canaux. Les petits décalages stokes permettent la capture simultanée de plusieurs canaux d’imagerie, ce qui permet de suivre plusieurs organites à la fois. Enfin, ils peuvent également être appliqués au marquage des organites dans les embryons d’autres espèces de drosophiles ou même d’autres insectes où aucune protéine marquée par fluorescence ne peut être disponible.
Cependant, la plupart de ces PF ne peuvent pas traverser la coquille d’œuf élaborée de l’embryon de drosophile . Il se compose de cinq couches: trois couches chorioniques externes (chorion) qui empêchent les dommages mécaniques plus une couche cireuse entourant la membrane vitelline qui crée une barrière chimique12. Pour plus de simplicité, la combinaison de la couche cireuse et de la membrane vitelline sera appelée « membrane vitelline » ci-dessous. Pour contourner la coquille d’œuf, ce protocole adapte une approche de micro-injection embryonnaire établie pour introduire des PF dans l’embryon de drosophile . Le protocole décrit comment surveiller le flux cytoplasmique des TA dans les embryons en phase de clivage. Il comprend la préparation des aiguilles d’injection et des cages de collecte d’œufs, le processus de collecte des œufs et le retrait mécanique du chorion. Il explique comment microinjecter et imager les embryons et comment analyser le flux global de LD à l’aide de la vélocimétrie par image de particules (PIV, adapté de6). Il fournit des conseils sur le dépannage pour assurer la survie de l’embryon et créer le meilleur système pour l’imagerie. Il est également question de savoir comment le protocole peut être modifié pour imager simultanément les LD et les microtubules ou pour l’appliquer à l’étude d’autres organites, y compris les lysosomes, les mitochondries, les vésicules vitellins et le réticulum endoplasmique (RE).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’embryon de drosophile est un modèle puissant et pratique pour étudier des questions fondamentales en biologie cellulaire et des organismes. Sa simplicité relative, sa génétique puissante et sa petite taille en font un excellent système d’imagerie des processus cellulaires et du développement. Ici, un protocole de micro-injection standard est adapté pour permettre l’utilisation de la FP chez les embryons. Cette approche permet l’imagerie fluorescente de structures cellulaires spécifiques sans avoir besoin de fluorophores génétiquement codés, ouvrant de nombreux arrière-plans génétiques à l’imagerie. La combinaison de plusieurs colorants et de protéines marquées par fluorescence stratégiquement choisies peut ouvrir l’imagerie en direct multicanal couvrant tout le spectre de la lumière visible.
Étapes critiques du protocole :
Ce protocole utilise BODIPY 493/503 pour étiqueter les LD. Cette approche peut facilement être adaptée pour marquer d’autres structures cellulaires. Pour l’analyse ultérieure de l’image, l’un des facteurs les plus importants est le rapport signal/bruit, c’est-à-dire la luminosité du colorant par rapport au signal d’arrière-plan. Les lysosomes ont été imagés avec succès (LysoTracker Red, 1 mM), ainsi que les mitochondries (Mitoview 633, 200 μM), les RE (ER tracker Green, 10 μM) et les microtubules (sirculine SiR, 200 nM dans DMSO), comme le montre la figure 2, figure 3, figure 4, figure 5. De plus, les vésicules vitellins sont autofluorescentes et émettent de la lumière bleue lors de l’excitation UV (image utilisant 405 nm comme longueur d’onde d’excitation (Figure 6)). Pour les autres colorants, visez à ce que la concentration de colorant soit de 100 à 1 000 fois supérieure à ce qui serait nécessaire pour colorer les cellules cultivées vivantes; ceci est similaire à la concentration d’une solution mère qui serait diluée dans un milieu de culture cellulaire. Comme ce protocole nécessite une injection de 100 fL et que l’embryon de drosophile est d’environ 9 nL dans le volume18, ces concentrations de colorants atteindront en moyenne une concentration embryonnaire interne inférieure à 1/100e de ce qui est présent dans le milieu de culture cellulaire. Temporairement, la concentration locale sera plus élevée au site d’injection, ce qui est particulièrement pertinent pour les PF qui ne diffusent pas bien (c.-à-d. les colorants mitochondriaux et la tubuline SiR). Pour ces PF, commencez aux concentrations élevées recommandées; si un décès inattendu est observé, diluer successivement deux fois jusqu’à ce qu’un compromis acceptable entre la survie et la force du signal soit atteint.
Lors de la co-injection de plusieurs colorants, les deux colorants doivent être dans le même solvant, ou les solvants et les colorants doivent être compatibles avec le mélange (des concentrations d’alcool supérieures à ~ 10% ne sont pas recommandées).
La qualité des aiguilles est essentielle au succès de cette procédure, car la pointe doit être aussi fine que possible. Sinon, les dommages causés par la plaie d’injection peuvent compromettre le développement ultérieur de l’embryon. Comme les extracteurs d’aiguilles commerciaux diffèrent, il est important de suivre les suggestions du fabricant et d’essayer plusieurs paramètres de traction jusqu’à ce que la forme souhaitée soit atteinte. Il est essentiel d’effectuer l’étape de contrôle de la qualité 1.1.3, car travailler avec une pointe d’aiguille fissurée, déchiquetée ou de gros calibre rendra l’injection réussie plus difficile, voire impossible.
L’embryon doit être partiellement desséché afin que des volumes supplémentaires de liquide puissent être ajoutés pendant l’injection. Si l’embryon est sous-desséché, l’aiguille n’entrera pas facilement et le cytoplasme giclera lorsque l’aiguille pénètre ou que la solution est injectée. Si l’embryon est trop desséché, il aura l’air dégonflé et ne se développera pas correctement. Le temps de séchage exact dépend des conditions locales, par exemple l’humidité de l’air, et peut changer d’un jour à l’autre. Il doit être déterminé empiriquement pour chaque session.
La capacité de l’embryon à survivre après microinjection dépend de manière critique de la qualité de l’aiguille, de la dessiccation appropriée et de la limitation du volume d’injection à moins de 1 pL (idéalement 100 fL). Tant que ces paramètres sont optimisés, aucune toxicité significative n’est apparente lorsque les colorants décrits sont injectés aux concentrations recommandées. Si les embryons survivent aux étapes de dessiccation et d’injection, ils se développent généralement avec succès dans l’extension de la bande germinale, à l’exception des sondes microtubule et ER qui ont causé des défauts de cellularisation à des niveaux élevés (injection de 100 fL de la concentration de stock de chacun). Les tests n’ont révélé aucun défaut de développement évident lorsque le DMSO, l’eau et les mélanges des deux ont été injectés aux volumes recommandés, avec un taux de survie embryonnaire par extension de la bande germinale d’environ 75% ou plus. Des volumes d’injection supérieurs à 1 pL ont provoqué des défauts et des embryons injectés avec des volumes d’environ 4 pL se sont développés pendant moins de 1 h. Par conséquent, les volumes d’injection doivent être maintenus bas, ce qui signifie que les concentrations de colorants doivent être élevées.
Généralement, les injections le long du bord latéral de l’embryon sont recommandées car elles entraînent le moins de dommages. Cependant, le site d’injection peut devoir être ajusté en fonction des propriétés diffusives des PF utilisés. BODIPY 493/503 et LysoTracker diffusent plus rapidement sur l’ensemble de l’embryon que Lipid Spot 610 (un autre colorant pour marquer les TA), tandis que SiR-Tubulin et Mitoview 633 ne diffusent jamais complètement à travers l’embryon (imagerie jusqu’à 7 h après l’injection). Ainsi, l’injection dans ou près du site d’intérêt peut être nécessaire. Lors de l’injection dans les régions antérieures ou postérieures, une aiguille particulièrement fine est recommandée.
L’acquisition d’images repose sur la microscopie confocale pour sectionner optiquement et résoudre les petits organites et tous les composants du cytosquelette. Les techniques nécessitant l’analyse de nombreuses images (par exemple, STORM ou PALM) ne fonctionneront pas parce que le contenu embryonnaire est en mouvement et que les fluorophores ne sont pas optimisés pour la commutation de photos. La microscopie à épifluorescence n’a pas la résolution latérale et axiale pour distinguer la plupart des organites et des structures cellulaires plus petites. Pour ces raisons, il est fortement recommandé d’utiliser un microscope confocal ou d’utiliser la technologie des feuilles de lumière.
La reproductibilité de l’analyse d’image repose en grande partie sur des données d’imagerie cohérentes. Pour avoir le plus de chances de succès, il est nécessaire d’optimiser la technique d’injection et l’acquisition d’images. L’établissement et la pratique d’une technique où le ou les colorants d’intérêt, le site d’injection, l’âge de l’embryon, le volume d’injection et la configuration d’acquisition sont tous cohérents généreront les données les plus robustes pour l’analyse d’images.
Modifications et dépannage de la méthode
Ce protocole démontre une méthode d’analyse du flux global de TA dans les embryons en phase de clivage à l’aide de la vélocimétrie par image de particules. La même approche peut être utilisée pour d’autres organites, d’autres stades de développement et d’autres méthodes d’analyse. Par exemple, la figure 2 montre l’analyse des LD et des organites acides qui s’écoulent dans les stades syncytiaux de l’embryogenèse, visualisés en co-injectant BODIPY 493/503 et LysoTracker Red. D’autres images réussies du mouvement de la LD chez les embryons jusqu’à 7 heures après la fécondation ont été réalisées; ces embryons conservent la plaie d’injection mais sont capables de se développer pendant plusieurs heures.
Les données recueillies à l’aide de ce protocole ont été utilisées pour la vélocimétrie d’image de particules, mais de nombreuses autres techniques d’analyse sont disponibles. Par exemple, les programmes de suivi des particules comme ceux trouvés dans ImageJ, Imaris ou le suivi manuel peuvent être utilisés pour obtenir les vitesses et les directionnalités des structures en mouvement. Notez que la plupart de ces logiciels de suivi sont conçus pour fonctionner avec les données des systèmes de culture cellulaire planaire et ne s’adaptent pas toujours bien aux structures 3D comme l’embryon de drosophile . De plus, pour la génération de données de suivi des particules de la meilleure qualité, plusieurs plans Z devraient être imagés; cela devrait être faisable si les temps d’acquisition de la pile d’images sont inférieurs à ~2 s. Ce point de repère devrait être accessible sur les systèmes confocaux à disque rotatif, à feuille de lumière en treillis et aux systèmes confocaux à balayage laser récents. Cependant, la faisabilité du suivi des particules pour les organites abondants tels que les TA, les mitochondries et les lysosomes est faible car la quantité de signal positif dans un champ de vision est trop élevée pour les méthodes de suivi actuelles. Le suivi de structures moins abondantes comme les noyaux ou les vésicules vitellins peut être possible. PIV pour l’analyse d’écoulement fonctionne bien pour les LD et les organites acides dans les stades de clivage parce que les deux organites se déplacent librement. Les organites comme les noyaux, les RE et les mitochondries sont attachés à d’autres structures cellulaires et ne se déplacent donc pas librement et ne sont pas adaptés à l’analyse logicielle qui suppose un mouvement libre. L’investigateur doit choisir les techniques les mieux adaptées à l’organite d’intérêt.
Au cours des phases syncytiale et blastodermique cellulaire, les LD (ainsi que d’autres organites) se déplacent le long de microtubules orientés radialement5. Il est donc possible de trouver des vues transversales (comme sur la figure 5) où des microtubules simples sont mis au point sur de longues distances, permettant le suivi des particules en 2D. Étant donné que ces plans optiques sont profonds dans l’embryon, la force globale du signal est diminuée et le rapport signal/bruit est réduit.
Pour l’analyse de suivi, l’imagerie aussi rapide que possible peut révéler des détails cruciaux du mouvement et donc de la machine mobile. Par exemple, le mouvement lipid-gouttelette est un mélange de deux états mobiles, le mouvement lent-court (~200 nm/s; distance moyenne de déplacement ~100 nm) et le mouvement rapide-long (~450 nm/s; distance de déplacement moyenne ~1 000 nm)19; ainsi, si des images sont prises toutes les secondes ou même moins fréquemment, l’état lent-court devient indétectable. Cependant, l’imagerie fréquente induit également le blanchiment des fluorophores et la phototoxicité. Les conditions d’imagerie doivent donc être ajustées en fonction de la question exacte à traiter.
Limites de la méthode
Selon le colorant souhaité, la méthode peut être limitée par la compatibilité entre la solubilité du colorant et la toxicité de la solution injectable. Les alcools comme l’isopropanol et l’éthanol sont difficiles à manipuler dans une aiguille en raison de leur viscosité plus faible et semblent endommager les composants cellulaires et tuer l’embryon.
La méthode n’est pas non plus bien adaptée à la visualisation des premières étapes de l’embryogenèse, car il faut plus de 30 minutes pour préparer les embryons à l’injection. À température ambiante, les cycles cellulaires initiaux de l’embryon ne durent que 10 minutes chacun; Ainsi, même si l’on devait cueillir un ovule nouvellement fécondé à l’étape 5.2.3, les premiers cycles cellulaires seraient déjà terminés au moment où l’embryon est prêt pour l’imagerie.
L’éclairage avec une lumière dans la gamme UV/bleu est considérablement plus phototoxique que pour les longueurs d’onde plus longues. Dans de telles conditions (p. ex., pour suivre des vésicules de jaune autofluorescentes; Figure 6), il faut limiter le temps d’imagerie (ce qui conduit à des séries chronologiques plus courtes) ou utiliser une puissance laser plus faible (ce qui entraîne une réduction du rapport signal/bruit).
Après la cellularisation, les colorants injectés dans un endroit spécifique ont tendance à mal diffuser, car ils doivent traverser de nombreuses membranes cellulaires. Cela limite la région d’observation dans les stades de développement ultérieurs.
L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives
Le mouvement des TA et d’autres organites contenant des lipides dans les embryons précoces peut être visualisé avec des fluorophores génétiquement codés, des techniques sans étiquette et par l’introduction de FP. Ce dernier peut être réalisé par perméabilisation de la membrane vitelline12 ou par l’approche de micro-injection discutée ici.
Les fluorophores génétiquement codés sont des marqueurs polyvalents dont les niveaux sont généralement hautement reproductibles d’un embryon à l’autre. Cependant, ils ont des rendements quantiques plus faibles et blanchissent plus facilement que les FP. En règle générale, ils ne sont disponibles que dans une ou deux versions marquées (par exemple, GFP ou mCherry), ce qui limite le choix des structures pouvant être imagées simultanément. Les PF, en revanche, existent souvent dans une grande variété; par exemple, divers colorants spécifiques aux gouttelettes lipidiques sont disponibles avec des spectres d’émission allant d’Autodot dans le spectre UV/bleu à Lipidtox et LipidSpot 610 dans le spectre rouge lointain. Les PF peuvent également être appliqués directement à n’importe quelle souche d’intérêt, et ne nécessitent donc pas de construction de souche pour, par exemple, introduire le marqueur d’organite souhaité dans une souche mutante d’intérêt. Cet avantage est particulièrement prononcé lorsque plusieurs structures doivent être étiquetées simultanément; au lieu de croisements chronophages couvrant plusieurs générations, cela peut être réalisé en une seule journée en mélangeant les colorants pertinents et en les introduisant en même temps. Enfin, si les processus cellulaires doivent être sondés avec une inhibition pharmacologique, les médicaments et les colorants peuvent être introduits ensemble.
Les méthodes sans étiquette sont des approches très puissantes pour détecter des structures cellulaires spécifiques. Par exemple, les TA peuvent être spécifiquement détectées chez les embryons précoces par microscopie de troisième génération harmonique20 ou par microscopie à perte raman stimulée femtoseconde21. Comme les PF, ces approches peuvent être appliquées dans n’importe quel fond génétique, et parce qu’elles ne provoquent pas de blanchiment, elles permettent potentiellement une acquisition d’image plus rapide. Cependant, ils sont généralement limités à des organites spécifiques et ne prennent donc pas en charge l’imagerie multiplexe; ils nécessitent également des microscopes spécialisés.
Il existe deux stratégies générales pour introduire de petites molécules dans les embryons. L’un est l’approche de micro-injection employée ici; l’autre est un traitement chimique (terpène) pour perméabiliser la membrane vitelline. Cette dernière approche12 est moins impliquée que la microinjection, mais aussi plus variable d’un embryon à l’autre. De plus, après la perméabilisation, la protection fournie par la membrane vitelline est compromise et l’embryon proprement dit est accessible au milieu externe, ce qui rend plus difficile son maintien en vie. La microinjection est beaucoup moins susceptible de faire dérailler le développement embryonnaire que la perméabilisation. Cependant, la perméabilisation est recommandée si de nombreux embryons doivent être surveillés simultanément, par exemple à des fins de dépistage de drogues. Pour suivre le mouvement des structures cellulaires et obtenir des séries d’images reproductibles adaptées à l’analyse d’images, la microinjection est la méthode de choix.
Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques
L’embryon de drosophile est un système modèle important pour l’étude de nombreux processus cellulaires, biologiques etdéveloppementaux 1,5,6. Le marquage des organites avec des protéines fluorescentes a apporté des contributions majeures à la compréhension de la façon dont l’embryon précoce se développe, comment divers organites circulent et comment ce trafic est modulé sur le plan du développement et génétiquement. Cependant, leur propension à blanchir et les défis liés à la génération de souches dans lesquelles plusieurs organites sont étiquetés avec des couleurs différentes limitent l’application de cette approche. L’utilisation de FP introduits par micro-injection résout bon nombre de ces défis et peut même être combinée avec des protéines marquées par fluorescence. Cette technique permet l’imagerie de multiples organites, structures cellulaires et composants du cytosquelette dans n’importe quel fond génétique. En conséquence, plusieurs génotypes peuvent être comparés via l’imagerie en direct, ce qui permet de déterminer l’effet des mutations sur le trafic de plusieurs organites.
Ce protocole démontre l’approche d’injection FP pour les embryons de Drosophila melanogaster, mais en principe, cette approche s’applique à tous les œufs d’insectes pour lesquels des techniques de micro-injection ont été établies, y compris d’autres espèces de drosophiles, de grillons22 et de pucerons23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang et Roger White pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous remercions Patrick Oakes, Stefano Di Talia et Victoria Deneke d’avoir partagé leur expertise sur la façon d’effectuer une analyse PIV. Ce travail a été soutenu par les subventions F31 HD100127 des National Institutes of Health (à M. D. K.) et R01 GM102155 (à M. A. W).
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
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