Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila
Summary
No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.
Abstract
Os embriões drosophila primitivos são grandes células contendo uma vasta gama de organelas convencionais e específicas de embriões. Durante as primeiras três horas de embriogênese, essas organelas sofrem movimentos dramáticos alimentados pelo streaming citoplasmica baseado em actina e tráfico motorizado ao longo de microtúbulos. O desenvolvimento de uma infinidade de pequenas sondas fluorescentes específicas de organela (FPs) torna possível visualizar uma ampla gama de diferentes estruturas contendo lipídios em qualquer genótipo, permitindo imagens vivas sem exigir um fluoróforo geneticamente codificado. Este protocolo mostra como injetar corantes vitais e sondas moleculares em embriões de Drosophila para monitorar o tráfico de organelas específicas por imagens vivas. Essa abordagem é demonstrada pela rotulagem de gotículas lipídicas (LDs) e seguindo seu movimento em massa por velocimetria de imagem de partículas (PIV). Este protocolo fornece uma estratégia favorável ao estudo de outras organelas, incluindo lisosomos, mitocôndrias, vesículas de gema e er, e para o rastreamento do movimento de LDs individuais ao longo de microtúbulos. O uso de corantes disponíveis comercialmente traz os benefícios da separação para as regiões violeta/azul e vermelha do espectro. Pela co-rotulagem multiplex de organelas e/ou elementos citoesqueléticos via microinjeção, todos os recursos genéticos em Drosophila estão disponíveis para estudos de tráfico sem a necessidade de introduzir proteínas fluorescentes marcadas. Ao contrário dos fluoroforos geneticamente codificados, que têm baixos rendimentos quânticos e alvejante facilmente, muitos dos corantes disponíveis permitem uma captura rápida e simultânea de vários canais com alto rendimento de fótons.
Introduction
Corantes vitais e sondas moleculares são ferramentas poderosas para imaginar estruturas celulares específicas e organelas ao vivo. No embrião de Drosophila, muitas organelas diferentes exibem localização orientada por citoesqueleto 1,2,3,4, mas a aplicação dessas pequenas moléculas é desafiadora porque a casca de ovo é impermeável para muitas delas. Este protocolo descreve um método para usar sondas fluorescentes (FPs) em embriões vivos via microinjeção, a fim de detectar o tráfico em larga escala de organelas. O procedimento abrange a preparação da solução de injeção, coleta de óvulos e preparação de embriões, microinjeção, imagem e análise de imagem.
Rearranjos espaciais dramáticos de organelas são comuns em muitos oócitos animais, ovos e embriões, em parte devido ao grande tamanho dessas células. No embrião de Drosophila , por exemplo, gotículas lipídicas (LDs) e vesículas de gema se movem em direção ao centro do embrião pouco antes da cellularização5. Este movimento depende de microtúbulos e deixa uma região de ~40 μm em toda a periferia do embrião esgotado das duas organelas. Durante os estágios anteriores de decote, muitas organelas são transportadas por fluxos citoplasmados que são impulsionados por contrações baseadas em actina-miose na superfície do embrião6. Embora os embriões de muitas espécies apresentem rearranjos semelhantes, o embrião Drosophila é particularmente adequado para seguir esses processos por imagem, porque se desenvolve externamente a “temperatura ambiente” padrão de laboratório, é relativamente transparente, pequeno o suficiente para caber na maioria das configurações de microscópio, e pode ser manipulado usando poderosas ferramentas genéticas.
Para algumas organelas, estão disponíveis proteínas fluorescentes que rotulam especificamente essas estruturas. Por exemplo, lSD-2 (também conhecido como dPLIN2) é uma proteína que em embriões tem como alvo especificamente os LDs7. Linhas de mosca estão disponíveis que carregam transgenes indutíveis codificando uma fusão entre proteína fluorescente verde (GFP) e LSD-28 ou uma armadilha genética na qual a proteína fluorescente amarela (YFP) é inserida na região de codificação do gene LSD-2 endógeno 9,10. No entanto, essa abordagem tem limitações, incluindo que essas proteínas de fusão têm baixos rendimentos quânticos e tendem a branquear facilmente. Além disso, rotular várias estruturas diferentes simultaneamente pode ser um desafio: para muitas organelas, apenas um tipo de tag fluorescente (muitas vezes GFP ou mCherry) está atualmente disponível, de modo que a imagem de duas organelas ao mesmo tempo pode exigir novos transgenes ou inserções; também, mesmo que as tags compatíveis estejam disponíveis, introduzi-las em uma única cepa pode exigir cruzes demoradas. Também torna o uso dos muitos recursos genéticos poderosos menos convenientes, por exemplo, se dois marcadores de organela, um motorista gal4, e uma construção RNAi indutível todos têm que estar presentes na mesma mãe.
Em princípio, essas limitações podem ser superadas com o uso de FPs, incluindo corantes vitais (por exemplo, LysoTracker para marcar lisosomos), sondas moleculares (por exemplo, SiR-tubulin para rotular microtúbulos) e moléculas biológicas fluorescentes rotuladas (por exemplo, C12 BODIPY para sondar o metabolismo de ácidos graxos11). A partir do uso em células cultivadas, elas são tipicamente bem validadas como ferramentas poderosas para sondar a biologia celular. Os FPs são versáteis, possuem propriedades fotográficas superiores e são compatíveis com proteínas fluorescentes. Múltiplos corantes podem ser misturados e aplicados simultaneamente, muitas vezes com os benefícios da separação nas áreas violeta/azul e vermelho distante do espectro e pequenas mudanças de Stokes, impedindo a sangria do canal. Pequenas mudanças de Stokes permitem a captura simultânea de múltiplos canais de imagem, permitindo o rastreamento de várias organelas ao mesmo tempo. Finalmente, eles podem ser igualmente aplicados à rotulagem de organelas nos embriões de outras espécies de Drosophila ou mesmo outros insetos onde não podem estar disponíveis proteínas fluorescentes.
No entanto, a maioria desses FPs não pode atravessar a casca de ovo elaborada do embrião Drosophila . Consiste em cinco camadas: três camadas coriônicas externas (chorão) que previnem danos mecânicos mais uma camada cerada ao redor da membrana vitelline que cria uma barreira química12. Para simplificar, a combinação da camada cerada e da membrana vitelline será referida como a “membrana vitelline” abaixo. Para contornar a casca de ovo, este protocolo adapta uma abordagem estabelecida de microinjeção de embriões para introduzir FPs no embrião de Drosophila . O protocolo descreve como monitorar o fluxo citoplasmado de LDs em embriões estágio de decote. Inclui a preparação de agulhas de injeção e gaiolas de coleta de ovos, o processo de coleta de ovos e a remoção mecânica do acorde. Ele analisa como microinjetar e imaginar os embriões e como analisar o fluxo a granel de LDs usando velocimetria de imagem de partículas (PIV, adaptada a partir de6). Ele fornece conselhos sobre solução de problemas para garantir a sobrevivência de embriões e criar o melhor sistema de imagem. Também é discutido como o protocolo pode ser modificado para imagem simultânea de LDs e microtúbulos ou para aplicá-lo ao estudo de outras organelas, incluindo lisosomos, mitocôndrias, vesículas de gema e o tiquelto endoplasmático (ER).
Protocol
Representative Results
Discussion
O embrião de Drosophila é um modelo poderoso e conveniente para estudar questões fundamentais na biologia celular e organismo. Sua relativa simplicidade, genética poderosa e tamanho pequeno fazem dele um excelente sistema para imagens, tanto processos celulares quanto desenvolvimento. Aqui, um protocolo padrão de microinjeção é adaptado para permitir o uso de FP em embriões. Esta abordagem permite imagens fluorescentes de estruturas celulares específicas sem a necessidade de fluoroforos geneticamente codificados, abrindo muitas origens genéticas para a imagem. A combinação de múltiplos corantes e proteínas marcadas fluorescentes estrategicamente escolhidas podem abrir imagens ao vivo multicanais abrangendo todo o espectro de luz visível.
Passos críticos no protocolo:
Este protocolo usa o BODIPY 493/503 para rotular LDs. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para marcar outras estruturas celulares. Para análise de imagem subsequente, um dos fatores mais importantes é a relação sinal-ruído, ou seja, o brilho do corante em comparação com o sinal de fundo. Lysosomes foram com sucesso imagens (LysoTracker Red, 1 mM), bem como mitocôndrias (Mitoview 633, 200 μM), o ER (ER tracker Green, 10 μM) e microtúbulos (SiR tubulin, 200 nM em DMSO), como mostrado na Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5. Além disso, as vesículas de gema são autofluorescentes e emissam luz azul sobre a excitação UV (imagem usando 405 nm como o comprimento de onda de excitação (Figura 6)). Para outros corantes, a meta é que a concentração de corante seja de 100 a 1.000x do que seria necessário para a coloração de células cultivadas ao vivo; isso é semelhante à concentração de uma solução de estoque que seria diluída em meios de cultura celular. Como este protocolo exige uma injeção de 100 fL e o embrião de Drosophila é de aproximadamente 9 nL no volume18, essas concentrações de corante saem em média para uma concentração embrionária interna de menos de 1/100 do que está presente na mídia da cultura celular. Temporariamente, a concentração local será maior no local da injeção, o que é mais relevante para os FPs que não difundem bem (ou seja, corantes mitocondriais e SiR-tubulin). Para estes FPs, comece pelas altas concentrações recomendadas; se for observada uma morte inesperada, dilui sucessivamente duas vezes até que um compromisso aceitável entre sobrevivência e força de sinal seja alcançado.
Ao co-injetar vários corantes, ambos os corantes devem estar no mesmo solvente, ou tanto os solventes quanto os corantes devem ser compatíveis com a mistura (concentrações de álcool superiores a ~10% não são recomendadas).
A qualidade das agulhas é essencial para o sucesso deste procedimento, pois a ponta precisa ser a melhor possível. Caso contrário, danos causados pela ferida de injeção podem comprometer o desenvolvimento subsequente do embrião. Como os puxadores de agulha comercial diferem, é importante seguir as sugestões do fabricante e experimentar vários parâmetros de puxar até que a forma desejada seja alcançada. É fundamental realizar o controle de qualidade passo 1.1.3, pois trabalhar com uma ponta de agulha rachada, irregular ou grande furo tornará a injeção bem sucedida mais difícil ou até mesmo impossível.
O embrião precisa ser parcialmente dessecado para que volumes adicionais de líquido possam ser adicionados durante a injeção. Se o embrião estiver sub-dessecado, a agulha não entrará facilmente, e o citoplasma irá esguichar à medida que a agulha penetra ou à medida que a solução é injetada. Se o embrião estiver super dessecado, ele parecerá esvaziado e não se desenvolverá adequadamente. O tempo exato de secagem depende das condições locais, por exemplo, da umidade do ar, e pode mudar de dia para dia. Tem que ser determinado empiricamente para cada sessão.
A capacidade do embrião de sobreviver após a microinjeção depende criticamente da qualidade da agulha, da dessecação adequada e da limitação do volume de injeção a menos de 1 pL (idealmente 100 fL). Enquanto esses parâmetros forem otimizados, nenhuma toxicidade significativa é aparente quando os corantes descritos são injetados nas concentrações recomendadas. Se os embriões sobrevivem aos passos de dessecação e injeção, eles normalmente se desenvolvem com sucesso na extensão da banda germinal, uma exceção sendo as sondas microtúbula e ER que causaram defeitos de celularização em altos níveis (injeção de 100 fL da concentração de estoque de cada um). Os testes não encontraram defeitos óbvios de desenvolvimento quando dMSO, água e misturas dos dois foram injetados nos volumes recomendados, com uma taxa de sobrevivência embrionária através de extensão de banda germinal de ~75% ou mais. Volumes de injeção acima de 1 pL causaram defeitos e embriões injetados com ~4 pL de volumes desenvolvidos por menos de 1h. Portanto, os volumes de injeção precisam ser mantidos baixos, o que significa que as concentrações de corante devem ser altas.
Geralmente, as injeções ao longo da borda lateral do embrião são recomendadas como resultado do menor dano. No entanto, o local de injeção pode precisar ser ajustado dependendo das propriedades difusivas dos FPs empregados. BODIPY 493/503 e LysoTracker difundem mais rápido em todo o embrião do que lipídio Spot 610 (outro corante para marcar LDs), enquanto SiR-Tubulin e Mitoview 633 nunca se difundem totalmente através do embrião (imagens até 7h após a injeção). Assim, pode ser necessária a injeção dentro ou perto do local de interesse. Ao injetar nas regiões anterior ou posterior, recomenda-se uma agulha particularmente fina.
A aquisição de imagens conta com microscopia confocal para seção óptica e resolução de pequenas organelas e todos os componentes citoesqueléticos. Técnicas que requerem análise de muitas imagens (por exemplo, STORM ou PALM) não funcionarão porque os conteúdos embrionários estão em movimento e os fluoroforos não são otimizados para fotossaritching. A microscopia de epifluorescência carece da resolução lateral e axial para fazer a maioria das organelas e estruturas celulares menores. Por essas razões, é fortemente recomendado usar um microscópio confocal ou empregar tecnologia de folha de luz.
A reprodutibilidade da análise de imagem depende muito de dados de imagem consistentes. Para a maior chance de sucesso, é necessária a otimização da técnica de injeção e aquisição de imagem. Estabelecer e praticar uma técnica onde o corante(s) de interesse, local de injeção, idade do embrião, volume de injeção e configuração de aquisição são todos consistentes irá gerar os dados mais robustos para análise de imagem.
Modificações e solução de problemas do método
Este protocolo demonstra um método para analisar o fluxo a granel de LDs em embriões estágio de decote usando velocimetria de imagem de partículas. A mesma abordagem pode ser usada para outras organelas, outros estágios de desenvolvimento e outros métodos de análise. Por exemplo, a Figura 2 mostra a análise de LDs e organelas ácidas fluindo nos estágios siníntiicos da embriogênese, visualizadas pela co-injeção BODIPY 493/503 e LysoTracker Red. Mais imagens bem sucedidas do movimento LD em embriões até 7 h pós-fertilização foram obtidas; esses embriões retêm a ferida de injeção, mas são capazes de se desenvolver por várias horas.
Os dados coletados usando este protocolo têm sido usados para velocimetria de imagem de partículas, mas muitas outras técnicas de análise estão disponíveis. Por exemplo, programas de rastreamento de partículas como os encontrados no ImageJ, Imaris ou rastreamento manual podem ser usados para obter velocidades e direcionais de estruturas móveis. Observe que a maioria desses softwares de rastreamento são construídos para trabalhar com dados de sistemas de cultura de células planar e nem sempre se adaptam bem a estruturas 3D como o embrião Drosophila . Além disso, para a geração dos dados de rastreamento de partículas de melhor qualidade, vários planos Z precisariam ser imagens; isso deve ser viável se os tempos de aquisição da pilha de imagens estiverem abaixo de ~2 s. Este benchmark deve ser alcançável em disco giratório confocal, folha de luz de rede e sistemas confocal de varredura a laser recentes. No entanto, a viabilidade do rastreamento de partículas para organelas abundantes, como LDs, mitocôndrias e lysosomes é baixa, pois a quantidade de sinal positivo em um campo de visão é muito alta para os métodos de rastreamento atuais. O rastreamento de estruturas menos abundantes como nuclei ou vesículas de gema pode ser possível. PIV para análise de fluxo funciona bem para LDs e organelas ácidas em estágios de decote porque ambas as organelas se movem livremente. Organelas como núcleos, ER e mitocôndrias estão amarradas a outras estruturas celulares e, portanto, não se movem livremente e não são adequadas à análise de software que assume o movimento livre. O investigador deve escolher as técnicas mais adequadas à organela de interesse.
Durante os estágios de blastoderm siníntial e celular, os LDs (bem como algumas outras organelas) se movem ao longo de microtúbulos radialmente orientados5. Portanto, é possível encontrar visões transversais (como na Figura 5) onde microtúbulos únicos estão em foco para longas distâncias, permitindo o rastreamento de partículas em 2D. Uma vez que esses planos ópticos estão dentro do embrião, a força geral do sinal é diminuída, e a relação sinal-ruído é reduzida.
Para análise de rastreamento, imagens o mais rápido possível podem revelar detalhes cruciais do movimento e, portanto, do maquinário motile. Por exemplo, o movimento de gotícula lipídica é uma mistura de dois estados motile, câmera lenta (~200 nm/s; distância média de viagem ~100 nm) e movimento rápido (~450 nm/s; distância média de viagem ~1.000 nm)19; assim, se as imagens são tiradas a cada segundo ou até menos com menos frequência, o estado lento-curto torna-se indetectável. No entanto, imagens frequentes também induz branqueamento fluorohore e fototoxicidade. As condições de imagem, portanto, devem ser ajustadas dependendo da pergunta exata a ser abordada.
Limitações do método
Dependendo do corante desejado, o método pode ser limitado pela compatibilidade entre a solubilidade do corante e a toxicidade da solução de injeção. Álcoois como isopropanol e etanol são difíceis de manusear dentro de uma agulha devido à sua viscosidade mais baixa e parecem danificar componentes celulares e matar o embrião.
O método também não é adequado para visualizar os primeiros passos da embriogênese porque leva mais de 30 minutos para preparar os embriões para injeção. À temperatura ambiente, os ciclos celulares iniciais do embrião têm apenas ~10 min de comprimento cada; assim, mesmo que se escolhesse um óvulo recém-fertilizado na etapa 5.2.3, os primeiros ciclos celulares já estariam concluídos quando o embrião estiver pronto para a imagem.
A iluminação com luz na faixa UV/azul é consideravelmente mais fototóxica do que para comprimentos de onda mais longos. Sob tais condições (por exemplo, para seguir vesículas de gema autofluorescentes; Figura 6), é preciso limitar o tempo de imagem (levando a séries de tempo mais curtas) ou usar menor potência laser (resultando em uma redução da relação sinal-ruído).
Após a celularização, os corantes injetados em um local específico tendem a difundir mal, pois devem atravessar muitas membranas celulares. Isso limita a região de observação em estágios posteriores de desenvolvimento.
A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
O movimento de LDs e outras organelas contendo lipídios em embriões primitivos pode ser visualizado com fluoroforos geneticamente codificados, técnicas livres de rótulos e pela introdução de FPs. Este último pode ser alcançado por permeabilização da membrana vitelline12 ou pela abordagem de microinjeção aqui discutida.
Fluoroforos geneticamente codificados são marcadores versáteis cujos níveis são tipicamente altamente reprodutíveis de embrião para embrião. No entanto, eles têm rendimentos quânticos mais baixos e branqueamento mais facilmente do que os FPs. Normalmente, eles só estão disponíveis em uma ou duas versões marcadas (por exemplo, GFP ou mCherry), limitando a escolha de quais estruturas podem ser imagens simultaneamente. Os FPs, por outro lado, muitas vezes existem em uma grande variedade; por exemplo, vários corantes específicos de gotículas lipídicas estão disponíveis com espectro de emissão de Autodot no espectro UV/azul para Lipidtox e LipidSpot 610 no espectro vermelho distante. Os FPs também podem ser diretamente aplicados a qualquer tensão de interesse e, portanto, não requerem a construção de tensão para, por exemplo, introduzir o marcador de organela desejado em uma variedade mutante de interesse. Essa vantagem é particularmente pronunciada quando múltiplas estruturas devem ser rotuladas simultaneamente; em vez de cruzes demoradas que abrangem várias gerações, isso pode ser alcançado em um único dia, misturando os corantes relevantes e introduzindo-os ao mesmo tempo. Finalmente, se os processos celulares forem sondados com inibição farmacológica, drogas e corantes podem ser introduzidos juntos.
Métodos sem rótulos são abordagens muito poderosas para detectar estruturas celulares específicas. Por exemplo, LDs podem ser especificamente detectados em embriões precoces por microscopia de terceira geração harmônica20 ou por microscopia estimulada de Perda de Raman21. Como os FPs, essas abordagens podem ser aplicadas em qualquer fundo genético, e por não causar branqueamento, elas potencialmente permitem uma aquisição mais rápida de imagens. No entanto, elas são tipicamente limitadas a organelas específicas e, portanto, não suportam por si só a imagem multiplex; eles também requerem microscópios especializados.
Existem duas estratégias gerais para introduzir pequenas moléculas em embriões. Uma delas é a abordagem de microinjeção empregada aqui; o outro é o tratamento químico (terpeno) para permeabiliizar a membrana vitelline. Esta última abordagem12 é menos envolvida do que a microinjeção, mas também mais variável de embrião para embrião. Além disso, após a permeabilização, a proteção fornecida pela membrana vitelline é comprometida e o embrião adequado é acessível ao meio externo, tornando mais desafiador mantê-lo vivo. Microinjeção é muito menos provável de descarrilar o desenvolvimento embrionário do que a permeabilização. No entanto, a permeabilização é recomendada se muitos embriões precisam ser monitorados simultaneamente, por exemplo, para fins de rastreamento de medicamentos. Para acompanhar o movimento das estruturas celulares e obter séries de imagens reprodutíveis adequadas para análise de imagens, microinjeção é o método de escolha.
Importância e aplicações potenciais do método em áreas específicas de pesquisa
O embrião de Drosophila é um importante sistema modelo para o estudo de muitos processos célula-biológicos e de desenvolvimento 1,5,6. A marcação de organelas com proteínas fluorescentes contribuiu muito para a compreensão de como o embrião precoce se desenvolve, como várias organelas traficam e como esse tráfico é modulado de forma desenvolviária e geneticamente. No entanto, sua propensão ao alvejante e os desafios de gerar cepas nas quais múltiplas organelas são rotuladas com cores diferentes limitam a aplicação dessa abordagem. O uso de FPs introduzidos pela microinjeção resolve muitos desses desafios e pode até ser combinado com proteínas fluorescentes marcadas. Esta técnica permite a imagem de múltiplas organelas, estruturas celulares e componentes citoesqueléticos em qualquer fundo genético. Como resultado, vários genótipos podem ser comparados via imagem ao vivo, possibilitando determinar o efeito de mutações no tráfico de múltiplas organelas.
Este protocolo demonstra a abordagem de injeção de FP para embriões de Drosophila melanogaster, mas, em princípio, essa abordagem se aplica a quaisquer ovos de insetos para os quais foram estabelecidas técnicas de microinjeção, incluindo outras espécies de Drosophila, grilos22 e pulgões23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang e Roger White por seus comentários sobre o manuscrito. Agradecemos a Patrick Oakes, Stefano Di Talia e Victoria Deneke por compartilharem seus conhecimentos sobre como realizar a análise do PIV. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, com o apoio do F31 HD100127 (para M. D. K.) e R01 GM102155 (para M. A. W).
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
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