Визуализация цитоскелет-зависимого трафика липидсодержащих органелл в эмбрионах дрозофилы

1. Подготовьте необходимые материалы ПРИМЕЧАНИЕ: Эти приготовления лучше всего делать за несколько дней или недель. Подготовьте инъекционные иглы.ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы могут храниться неопределенно долго в закрытом контейнере. Иглы должны быть достаточно тонкими, чтобы доставить ~ 700 fL, будучи достаточно прочными, чтобы проткнуть мембрану вителлина. Поместите капилляр в капиллярный держатель на съемнике иглы. Закрепите капилляр с помощью крыльевых гаек. Выровняйте центр капилляра с нагревательным элементом так, чтобы образовались две симметричные иглы. Выберите соответствующие настройки на съемнике иглы в соответствии с инструкциями производителя. Выполняйте контроль качества с помощью рассекающей области.ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики игл должны быть как можно тоньше. Потрескавшиеся, зубчатые или крупнокалиберные кончики игл выбрасываются. Готовьте партии по 10 игл (5 капилляров) за один раз. Поместите деформируемую шпаклевку, которая была свернута в цилиндр, в центре дна контейнера с крышкой. Осторожно вдавите иглы в шпаклевку так, чтобы она удерживала их горизонтально с наконечниками игл, надежно подвешенными в воздухе, чтобы предотвратить повреждение. Накройте крышкой и храните до использования. Подготовьте тарелки для сбора яиц. Хранить при температуре 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки для сбора яиц представляют собой небольшие агаровые пластины, дополненные фруктовым соком для стимулирования яйцекладки. Как их подготовить, описано во многих протоколах, в том числев 13. Приготовьте гептановый клей.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот клей извлекается из двусторонней ленты и используется для надежного прикрепления эмбрионов к крышке. Это останавливает эмбрион от выплытия из фокуса во время инъекции и визуализации. Клей можно приготовить за несколько дней или недель раньше срока. Поднимите двустороннюю ленту на размер больше, чем мяч для гольфа, и поместите ее на дно стеклянного контейнера объемом ~ 50 мл с плотно закрывающейся крышкой. Плотно упакуйте ленту, чтобы присутствовало достаточно клея. В вытяжном шкафу наполните стеклянный контейнер гептаном, чтобы покрыть всю ленту. Держите контейнер плотно закрытым, когда он не используется.ВНИМАНИЕ: Гептан легковоспламеняется в виде жидкости и пара. Это может вызвать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Пары дыхания могут вызвать сонливость, головокружение и повреждение легких. Храните гептан вдали от источников воспламенения и храните его в хорошо проветриваемом помещении, предназначенном для легковоспламеняющихся веществ, и вдали от несовместимых веществ. Дайте гептановому клею постоять на ночь или дольше. Для достижения наилучших результатов поместите контейнер на шейкер или другую мешалку на ночь, чтобы помочь с растворением клея.ПРИМЕЧАНИЕ: Сама лента останется, но клей растворится в гептане. На этапе 5.1.2 клей наносится на крышку; гептан испаряется, оставляя клей позади. Проверьте подготовку гептанового клея, поместив его каплю на стеклянную горку и убедившись, что после испарения гептана остается липкий остаток. Если остаток клея не виден после этого, добавьте больше ленты в стеклянный контейнер и повторите предыдущий шаг.ПРИМЕЧАНИЕ: После приготовления клей можно использовать в течение нескольких месяцев или даже лет. Готовят 1 мг/мл (3,8 мМ) БОДИПИ493/503 стоковым раствором путем разбавления коммерчески полученного препарата в чистом безводном ДМСО. Держите его закрытым, чтобы защитить его от света и воды. Хранить бессрочно при температуре -20 °C или при температуре 4 °C. 2. Подготовьте клетки для сбора яиц ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте это, по крайней мере, за день (предпочтительно за 2 или 3 дня) до запланированной инъекции (инъекций). Приготовьте дрожжевую пасту.ПРИМЕЧАНИЕ: Дрожжевая паста дополняет белок и другие жизненно важные питательные вещества, не содержащиеся в тарелках с яблочным соком. Способствует яйценоскости и яйцекладке. Добавьте 2-10 г сухих пекарских дрожжей, а затем 1 мл водопроводной воды в небольшой стакан. Перемешать шпателем. Продолжайте добавлять водопроводную воду с шагом 1 мл до тех пор, пока не будет достигнута желаемая консистенция, похожая на зубную пасту. Накройте смесь крышкой и храните при температуре 4 °C. Установите клетки для мух для сбора яиц.ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы и самки мух нужного генотипа обязательны: 10-50 самок в возрасте до 2 недель и аналогичное количество самцов. Доступен ряд различных вариантов нахлыстовых клеток, в том числе самодельные варианты14,13. Важно, чтобы размер тарелок с яблочным соком соответствовал размеру клеток для мух. Поместите небольшой мазок дрожжевой пасты на тарелку с яблочным соком. Держите его закрытым и дайте ему дойти до комнатной температуры, потому что мухи не будут откладывать яйца на тарелку, если будет слишком холодно. Перенесите мух в клетку для сбора эмбрионов, запечатайте пластиной с дрожжевым яблочным соком и закрепите пластину в клетке сбора эмбрионов. Дайте вновь перенесенным мухам акклиматизироваться в клетке в течение 1-2 дней, заменяя тарелку на свежую ежедневно. Если все дрожжи были съедены к следующему дню, увеличьте количество дрожжевой пасты для будущих сборов.ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг для повышения урожайности яиц, так как сытые самки откладывают больше яиц. 3. В день инъекции подготовьте инъекционный раствор и загрузите его в иглу Используйте стандартный раствор BODIPY 493/503 (3,8 мМ в ДМСО) в качестве раствора для инъекций. Загрузите одну иглу 1 мкл инъекционного раствора с помощью наконечников для загрузки иглы.ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь доставить жидкость до самого кончика, не улавливая пузырьки воздуха. Будьте готовы быстро заменить загруженную иглу в случае случайной поломки. Прикрепите загрузочный наконечник к микропипетке и втяните в наконечник 1 мкл раствора для инъекций. Используя перчатки, держите иглу в одной руке, отклонив ее кончик, чтобы свести к минимуму риск поломки. Осторожно вставьте загрузочный наконечник в иглу и прижмите его близко к кончику иглы. Дозируйте жидкость рядом с кончиком иглы. После снятия пипетки держите иглу вертикально кончиком вниз, пока жидкость не потечет к кончику. Храните загруженные иглы в отдельном контейнере со шпаклевкой, как указано выше (см. шаг 1.1.5).ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы должны быть приготовлены заранее (до нескольких часов) инъекции, но не должны использоваться более чем через день. Держите иглы подальше от окружающего света, чтобы предотвратить отбеливание красителей. Накройте контейнер для хранения алюминиевой фольгой, не повредив кончики игл. Убедитесь, что весь свет скрыт. 4. Сбор эмбрионов для инъекций ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки сбора зависят от того, на какой стадии эмбрионов должна быть выполнена инъекция. При приведенной ниже временной схеме эмбрионы на момент подготовки к инъекции будут иметь возраст 0-90 мин, что соответствует15 стадиям расщепления. В день инъекции приготовьте тарелки с яблочным соком с дрожжами, как на шаге 2.2.1. Если планируется N раундов инъекций, подготовьте N + 2 пластины. Храните эти пластины при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к N пластинам для сбора эмбрионов для инъекций, одна пластина необходима в качестве предварительной пластины, а другая для кормления мух в клетке после завершения сбора. Замените пластину на клетке на свежую дрожжевую тарелку (тарелку для предварительного сбора) и оставьте ее на клетке на 1-2 ч. Замените тарелку на клетке свежей тарелкой (коллекционной тарелкой). Отбросьте предсборную пластину, так как она будет содержать эмбрионы старше желаемого. Затем дайте мухам отложить яйца в течение 1,5 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сытые мухи обычно откладывают яйца вскоре после оплодотворения яиц, время сбора 1,5 часа гарантирует, что в конце сбора большинство эмбрионов на пластине имеют возраст 0-90 минут, то есть находятся в стадии расщепления. Самки мух, которых не кормили свежими дрожжами с предыдущего дня, как правило, сохраняют оплодотворенные яйца в течение некоторого неопределенного количества времени перед откладыванием. Следовательно, на предсборной пластине могут быть эмбрионы, которые были оплодотворены до начала сбора и, таким образом, старше 60 минут, иногда намного старше. Замените тарелку на клетке на свежую дрожжевую тарелку. Накройте тарелку сбора, чтобы бродячие мухи не откладывали на них яйца. 5. Подготовка эмбрионов к микроинъекции Соберите необходимые материалы. Прикрепите кусок двусторонней ленты к стеклянной горке. Избегайте прикосновения к ленте пальцами, так как это уменьшает ее липкость.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот слайд будет использоваться для удаления хориона, а не для визуализации. Используя передаточную пипетку или микропипетку (p200 или p1000), поместите небольшую каплю (200 мкл или менее) гептанового клея примерно в центр прямоугольного покровного листа (60 x 25 мм). Дайте гептану испариться (это занимает менее мин).ПРИМЕЧАНИЕ: Этот покров будет использоваться для крепления эмбрионов для инъекций и визуализации. Размеры выбраны таким образом, чтобы поместиться в регулируемый металлический держатель на конфокальном микроскопе. Соберите сушильную камеру, герметичную камеру (например, сэндвич-коробку Tupperware), содержащую высыхающие шарики. Используйте только высыхающие шарики, которые не увлажнены.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы эмбрионы принимали инъекционный раствор, эмбрион должен быть слегка высушен для снижения внутреннего давления. Это делается путем помещения покровного листа с дехорионированными, подвергшимися воздействию воздуха эмбрионами в камеру высыхания. Механически удаляют хорион. Накройте соответствующим образом выдержанную пластину эмбриона тонким слоем галогенуглеродного масла 27, чтобы сделать яичную скорлупу прозрачной.ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы становятся полупрозрачными в течение десятков секунд15. Если этот шаг не происходит эффективно, тарелки с яблочным соком могут быть слишком влажными и должны быть высушены перед использованием. Посмотрите на пластину под рассечением с трансиллюминацией (то есть светом, проходящим через пластину в окуляры), чтобы подтвердить стадию эмбрионов. Отбирайте эмбрионы на стадиях расщепления.ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы стадии декольте полностью непрозрачны; последующие стадии бластодермы могут быть распознаны по полосе прозрачной цитоплазмы вокруг непрозрачного центра15. Хорошее введение о том, как распознавать различные эмбриональные стадии, доступно на веб-сайте (приведено в ссылке16), поддерживаемом Обществом биологии развития. С помощью тонкого пинцета схватите зародыш нужной стадии за его спинные придатки и перенесите его на подготовленную стеклянную горку, покрытую куском двусторонней ленты. Поместите эмбрион на ленту. Сведите к минимуму перенос масла. Как можно осторожнее прокатите эмбрион по поверхности ленты, осторожно подталкивая эмбрион стороной кончика пинцета. Не тыкайте эмбрион непосредственно острыми кончиками пинцета.ПРИМЕЧАНИЕ: Если приложенное усилие слишком низкое, эмбрион не будет катиться. Если он будет слишком высоким, он лопнет. Нахождение соответствующих промежуточных сил требует опыта, и, таким образом, этот шаг следует практиковать заранее. Продолжайте катать эмбрион до тех пор, пока хорион временно не прилипнет к ленте и не треснет. Как только хорион треснет, продолжайте катиться, чтобы отделить эмбрион (все еще внутри мембраны вителлина) от хориона, поскольку хорион остается прилипшим к ленте. Подтвердите, что хорион полностью удален, наблюдая за потерей дорсальных придатков у эмбриона. Сверните эмбрион обратно на хорион, который менее клейкий, чем лента. Аккуратно натрите эмбрион пинцетом, пока он не прикрепится к пинцету для переноса. Перенесите эмбрион на крышку с гептановой клеем и приведите его в контакт с клеем, который обычно отделяет его от пинцета. Отрегулируйте ориентацию эмбриона на крышке. Встроить боковую поверхность эмбриона в клей.ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность эмбриона, встроенного в клей, будет изображена. Встраивание боковой поверхности является самым простым, но это может быть скорректировано в зависимости от личных предпочтений или биологического вопроса, на который необходимо ответить. Ориентируйте длинную ось эмбриона перпендикулярно длинной оси покрова. Если эмбрион не лежит в предпочтительной ориентации, очистите пинцет, чтобы удалить любое масло, которое отделяет эмбрион от клея. Затем осторожно попытайтесь свернуть эмбрион в положение. Подготовьте нужное количество эмбрионов для инъекции способом, описанным выше.ПРИМЕЧАНИЕ: По прошествии времени после удаления хориона окружающий воздух начнет высушивать эмбрионы, и, таким образом, эффект шага 5.3 будет неравномерным для эмбрионов на покрове, которые были дехорионированы в разное время. Как правило, 1-3 эмбриона являются наиболее управляемыми. Высушить эмбрионы. Поместите крышку с эмбрионами в подготовленную сушильную камеру и запечатайте ее. Дайте эмбрионам высохнуть в течение 5-12 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки этого этапа зависят от температуры и влажности окружающей среды и, следовательно, должны быть определены эмпирически. Снимите крышку из камеры и поместите на нее каплю галогенуглеродного масла 700, полностью покрыв эмбрионы, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание. Осмотрите эмбрионы на рассекающемся объеме, чтобы судить о правильном высыхании. Если эмбрионы просто слегка сморщены, но не сдулись, приступают к микроинъекции (шаг 6). Если эмбрионы недостаточно или чрезмерно высушены, вернитесь к шагу 5.2 и подготовьте новую партию эмбрионов, так как галогенуглеродное масло 700 не может быть удалено. Если эмбрионы были чрезмерно высушены, сократите время высыхания для следующей партии эмбрионов на 3 мин; если они были недостаточно высушены, увеличьте время высыхания на 3 мин. 6. Микроинъекционные эмбрионы ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что установка микроинъекции включает в себя перевернутый микроскоп, микроманипулятор для удержания и позиционирования инъекционной иглы и коммерческий микроинжектор для доставки контролируемых объемов. Включите микроинжектор и введите предпочтительные настройки.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола рекомендуется использовать линейный выход движения и быструю настройку, но многие другие будут работать. Оператор должен определить личные предпочтения. Загрузите иглу в микроманипулятор. Чтобы предотвратить повреждение иглы при загрузке крышки, содержащей эмбрионы, переместите ее с дороги в безопасное положение. Поместите крышку на сцену с эмбрионами сверху, к игле. Затем осторожно переместите иглу обратно в положение для инъекции, при этом ее кончик все еще значительно выше стадии. Поместите 4-кратный объектив на путь света. Используя ручку фокусировки на микроскопе, поместите эмбрионы в фокус.ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет фокальная плоскость, используемая для инъекций, и будет регулироваться только минимально в будущем. С помощью элементов управления стадией переместите эмбрионы горизонтально в центр поля зрения. Подойдите подальше от эмбрионов, удерживая их на краю поля зрения, в рамках подготовки к опусканию иглы. Оставайтесь в одной фокальной плоскости, чтобы убедиться, что игла опущена в правильное положение. Опустите кончик иглы в правильную фокальную плоскость и убедитесь, что он виден в поле зрения вместе с эмбрионами. Используя элементы управления микроманипулятора и глядя сверху (еще не через окуляры), медленно опустите кончик иглы в масло, нацеливаясь на область, на которую указывает цель. Поскольку масло довольно вязкое, идите медленно, чтобы не повредить иглу. Как только игла будет видна через окуляры, продолжайте использовать элементы управления микроманипулятора до тех пор, пока кончик иглы не окажется в фокусе и в центре поля зрения. Перемещая стадию, верните эмбрионы в центр поля зрения. Используйте управление сценой, микроманипулятор и ручку фокусировки для точной настройки положения эмбриона и кончика иглы относительно друг друга, пока оба находятся в фокусе. Старайтесь выполнять инъекции как можно ближе к крышке. Выполняйте контроль качества игл. Чтобы убедиться, что игла функциональна, дозируйте часть инъекционного раствора в галогенуглеродное масло 700, окружающее эмбрион, видимое как пузырь в масле. Если из иглы ничего не вытекает, постепенно увеличивайте давление на инжектор. Если это не сработает, приобретите новую иглу. Введите эмбрион.ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимые объемы впрыска варьируются от ~0,06-1 пл. Нижний предел устанавливается тем, что можно визуализировать, входя в эмбрион. Верхний предел устанавливается травмой, которую инъекция оказывает на эмбрион. Вводите вдоль боковых краев эмбриона, так как это наименее инвазивный. Используя элементы управления стадией, переместите эмбрион к кончику иглы, пока последний осторожно не проколет эмбрион и не войдет в него. При этом запустите поток инъекционного раствора и следите за появлением переходного прозрачного пятна на месте кончика иглы, что свидетельствует об успешном переносе жидкости в эмбрион. Следите за эмбрионом. Если эмбрион сопротивляется игле и разрывается (цитоплазма выплескивается наружу) при входе, вернитесь к шагу 5 и увеличьте время высыхания. Если эмбрион плоский по отношению к покрову и кажется гибким во время инъекции, вернитесь к шагу 5 и сократите время высыхания. Если краситель не попал в эмбрион, подтвердите, что краситель все еще может свободно течь из иглы, как на этапе 6.7. Если краситель не течет, замените иглу. Если краситель течет, введите новый эмбрион и начните выпускать краситель непосредственно перед тем, как игла проколет эмбрион.ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные инъекции одного и того же эмбриона не рекомендуются, так как он разрывает предыдущую рану / место инъекции. Повторяйте до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы. 7. Изображение эмбрионов ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Поместите крышку в металлический держатель на конфокальном микроскопе так, чтобы эмбрионы были изображены непосредственно снизу через крышку; над крышкой есть только масло и никакого другого барьера. В качестве этапа контроля качества сначала используйте функцию эпифлуоресценции на конфокальном микроскопе с 40-кратным объективом. Убедитесь, что флуорофор виден в эмбрионе, прежде чем продолжить. Если желаемая плоскость визуализации отличается от места инъекции, дайте достаточно времени, чтобы краситель диффундировал в целевую область.ПРИМЕЧАНИЕ: Для BOPIPY 493/503 это время обычно колеблется в пределах 30-60 мин. Поскольку время диффузии сильно зависит от красителя, другие красители могут потребовать оптимизации места инъекции и времени ожидания. Используйте различные цели для визуализации в разных масштабах. Используйте объектив 40x для изображения всего эмбриона и 63x объектив для изображения подразделов для меньших масштабов. Для визуализации в реальном времени во время синцитиальных стадий перед сотовой связью используйте следующие условия для начала: размер изображения 512 x 512 пикселей, среднее линейное значение 3, частота кадров 0,1 кадра в секунду (т. Е. 1 кадр, полученный каждые 10 с). Отрегулируйте условия в соответствии с возможностями используемого микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия позволяют получить ~500+ изображений из BOPIPY 493/503 и захватить большую часть движения. 8. Анализ потока LD сначала с помощью FIJI для подготовки временных рядов изображений, а затем python для анализа PIV Оптимизируйте получение изображений. Выполняют инъекции нужного красителя на соответствующем этапе. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока ежедневные изменения не будут незначительными. Оптимизируйте параметры получения изображений, включая увеличение, масштабирование, разрешение и частоту кадров.ПРИМЕЧАНИЕ: Существует компромисс между высококачественными изображениями (разрешение + усреднение строк) и скоростью захвата (частота кадров). Подготовка данных на ФИДЖИ. Приобретите высококачественные временные ряды для анализа. Откройте один кадр временного ряда, чтобы создать маску с помощью FIJI. Продублируйте изображение. Преобразуйте тип изображения в 8 бит. Определите границу эмбриона с помощью инструмента « Полигон » или «От руки». Используйте команду «Очистить снаружи», чтобы присвоить значениям пикселов вне выделенной области значение 0. Очистить , а затем Инвертировать в выделенной области, чтобы установить максимальное значение пикселов в выделенной области (255). Снимите флажок, затем используйте команду Histogram , чтобы убедиться, что присутствуют только значения пикселей 0 и 255. Сохраните эту новую маску изображения для определенного временного ряда. Откройте интересующий временной ряд. Выберите, какие десять кадров лучше всего фиксируют интересующее время, например, ядерный цикл 9 в начале коркового сокращения. Дублируйте десять интересующих кадров, образуя подстек. Используйте функцию Stack to Images для создания 10 изображений для анализа с помощью PIV. Сохраните отдельные файлы таким образом, чтобы сохранить их порядок (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 …). Используйте подготовленную маску и отдельные кадры для анализа PIV, используя предоставленный пример скрипта python (Дополнительные данные) или пользовательский скрипт, сгенерированный пользователем.ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный скрипт основан на приложении python OpenPIV17. Он выводит расстояние в пикселях, которые могут быть преобразованы с использованием ширины пикселей и частоты кадров для создания скоростей или скоростей. Создайте реплики, выполнив предыдущие шаги для дополнительных эмбрионов и скомпилировав выходные значения.