Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen
Summary
Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.
Abstract
Frühe Drosophila-Embryonen sind große Zellen, die eine Vielzahl konventioneller und embryospezifischer Organellen enthalten. Während der ersten drei Stunden der Embryogenese durchlaufen diese Organellen dramatische Bewegungen, die durch aktinbasiertes zytoplasmatisches Strömen und motorgetriebenen Verkehr entlang von Mikrotubuli angetrieben werden. Die Entwicklung einer Vielzahl kleiner, organellenspezifischer Fluoreszenzsonden (FPs) ermöglicht es, eine breite Palette verschiedener lipidhaltiger Strukturen in jedem Genotyp sichtbar zu machen, was eine Live-Bildgebung ermöglicht, ohne dass ein genetisch kodierter Fluorophor erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, wie man lebenswichtige Farbstoffe und molekulare Sonden in Drosophila-Embryonen injiziert, um den Handel mit bestimmten Organellen durch Lebendbildgebung zu überwachen. Dieser Ansatz wird durch die Markierung von Lipidtröpfchen (LDs) und die Verfolgung ihrer Massenbewegung durch Partikelbild-Velocimetrie (PIV) demonstriert. Dieses Protokoll bietet eine Strategie, die für die Untersuchung anderer Organellen, einschließlich Lysosomen, Mitochondrien, Dottervesikel und der Notaufnahme, sowie für die Verfolgung der Bewegung einzelner LDs entlang von Mikrotubuli geeignet ist. Die Verwendung kommerziell erhältlicher Farbstoffe bringt die Vorteile der Trennung in die violett / blauen und fernroten Bereiche des Spektrums. Durch die Multiplex-Co-Markierung von Organellen und/oder Zytoskelettelementen mittels Mikroinjektion stehen alle genetischen Ressourcen in Drosophila für Handelsstudien zur Verfügung, ohne dass fluoreszierend markierte Proteine eingeführt werden müssen. Im Gegensatz zu genetisch kodierten Fluorophoren, die geringe Quantenausbeuten und leicht Bleichmittel aufweisen, ermöglichen viele der verfügbaren Farbstoffe eine schnelle und gleichzeitige Erfassung mehrerer Kanäle mit hohen Photonenausbeuten.
Introduction
Vitale Farbstoffe und molekulare Sonden sind leistungsstarke Werkzeuge, um bestimmte Zellstrukturen und Organellen live abzubilden. Im Drosophila-Embryo zeigen viele verschiedene Organellen eine zytoskelettgetriebeneLokalisation 1,2,3,4, aber die Anwendung dieser kleinen Moleküle ist eine Herausforderung, da die Eierschale für viele von ihnen undurchlässig ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Verwendung von fluoreszierenden Sonden (FPs) in lebenden Embryonen durch Mikroinjektion, um den großflächigen Handel mit Organellen zu erkennen. Das Verfahren umfasst die Zubereitung der Injektionslösung, die Eizellentnahme und die Präparation von Embryonen, die Mikroinjektion, die Bildgebung und die Bildanalyse.
Dramatische räumliche Umlagerungen von Organellen sind in vielen tierischen Eizellen, Eiern und Embryonen üblich, zum Teil wegen der Größe dieser Zellen. Im Drosophila-Embryo zum Beispiel bewegen sich Lipidtröpfchen (LDs) und Dottervesikel kurz vor der Zellularisation in RichtungEmbryozentrum 5. Diese Bewegung hängt von Mikrotubuli ab und hinterlässt eine ~ 40 μm-Region rund um die Peripherie des Embryos, die von den beiden Organellen erschöpft ist. Während früherer Spaltungsstadien werden viele Organellen durch zytoplasmatische Ströme transportiert, die durch Aktin-Myosin-basierte Kontraktionen an der Embryooberflächeangetrieben werden 6. Obwohl die Embryonen vieler Arten ähnliche Umlagerungen aufweisen, ist der Drosophila-Embryo besonders geeignet, diese Prozesse durch Bildgebung zu verfolgen, da er sich bei Standardlabor-Raumtemperatur extern entwickelt, relativ transparent ist, klein genug ist, um auf die meisten Mikroskop-Setups zu passen, und mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen manipuliert werden kann.
Für einige Organellen stehen fluoreszierend markierte Proteine zur Verfügung, die diese Strukturen spezifisch markieren. Zum Beispiel ist LSD-2 (auch bekannt als dPLIN2) ein Protein, das in Embryonen spezifisch auf LDs7 abzielt. Es gibt Fliegenschnüre, die entweder induzierbare Transgene tragen, die für eine Fusion zwischen Green Fluorescent Protein (GFP) und LSD-28 kodieren, oder eine Genfalle, in der gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) in die kodierende Region des endogenen LSD-2-Gens 9,10 eingefügt wird. Dieser Ansatz hat jedoch Einschränkungen, einschließlich der Tatsache, dass diese Fusionsproteine geringe Quantenausbeuten haben und dazu neigen, leicht zu bleichen. Darüber hinaus kann die gleichzeitige Markierung mehrerer verschiedener Strukturen eine Herausforderung darstellen: Für viele Organellen ist derzeit nur eine Art von fluoreszierendem Tag (oft GFP oder mCherry) verfügbar, so dass die gleichzeitige Abbildung von zwei Organellen neue Transgene oder Insertionen erfordern kann; Selbst wenn kompatible Tags verfügbar sind, kann das Einbringen in eine einzelne Sorte zeitaufwändige Kreuzungen erfordern. Es macht auch die Nutzung der vielen mächtigen genetischen Ressourcen weniger bequem, z.B. wenn zwei Organellenmarker, ein Gal4-Treiber und ein induzierbares RNAi-Konstrukt alle in derselben Mutter vorhanden sein müssen.
Im Prinzip können diese Einschränkungen durch die Verwendung von FPs überwunden werden, einschließlich lebenswichtiger Farbstoffe (z. B. LysoTracker zur Markierung von Lysosomen), molekularen Sonden (z. B. SiR-Tubulin zur Markierung von Mikrotubuli) und fluoreszierend markierten biologischen Molekülen (z. B. C12 BODIPY zur Untersuchung des Fettsäurestoffwechsels11). Von der Verwendung in kultivierten Zellen sind sie in der Regel als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Zellbiologie gut validiert. FPs sind vielseitig, haben überlegene Fotoeigenschaften und sind mit fluoreszierenden Proteinen kompatibel. Mehrere Farbstoffe können gleichzeitig gemischt und aufgetragen werden, oft mit den Vorteilen der Trennung in die violett / blauen und fernroten Bereiche des Spektrums und kleiner Stokes-Verschiebungen, wodurch ein Durchbluten des Kanals verhindert wird. Kleine Stokes-Verschiebungen ermöglichen die gleichzeitige Erfassung mehrerer Bildgebungskanäle und ermöglichen die Verfolgung mehrerer Organellen gleichzeitig. Schließlich können sie auch zur Markierung von Organellen in den Embryonen anderer Drosophila-Arten oder sogar anderer Insekten angewendet werden, bei denen möglicherweise keine fluoreszierend markierten Proteine verfügbar sind.
Die meisten dieser FPs können jedoch die ausgeklügelte Eierschale des Drosophila-Embryos nicht durchqueren. Es besteht aus fünf Schichten: drei äußeren Chorionschichten (Chorion), die mechanische Schäden verhindern, sowie einer wachsartigen Schicht, die die Vitellinmembran umgibt und eine chemische Barriere12 bildet. Der Einfachheit halber wird die Kombination der wachsartigen Schicht und der Vitellinmembran im Folgenden als “Vitellinmembran” bezeichnet. Um die Eierschale zu umgehen, passt dieses Protokoll einen etablierten Embryo-Mikroinjektionsansatz an, um FPs in den Drosophila-Embryo einzuführen. Das Protokoll beschreibt, wie der zytoplasmatische Fluss von LDs in Embryonen im Spaltstadium überwacht werden kann. Es umfasst die Vorbereitung von Injektionsnadeln und Eiersammelkäfigen, den Prozess der Eizellentnahme und die mechanische Entfernung des Chorions. Es geht darum, wie man die Embryonen mikroinjiziert und abbildet und wie man den Massenstrom von LDs mit Hilfe der Partikelbild-Velocimetrie (PIV, angepasst von6) analysiert. Es bietet Ratschläge zur Fehlerbehebung, um das Überleben des Embryos sicherzustellen und das beste System für die Bildgebung zu schaffen. Es wird auch diskutiert, wie das Protokoll modifiziert werden kann, um LDs und Mikrotubuli gleichzeitig abzubilden oder es auf die Untersuchung anderer Organellen anzuwenden, einschließlich Lysosomen, Mitochondrien, Dottervesikel und des endoplasmatischen Retikulums (ER).
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Drosophila-Embryo ist ein leistungsfähiges und bequemes Modell, um grundlegende Fragen der Zell- und Organismenbiologie zu untersuchen. Seine relative Einfachheit, leistungsfähige Genetik und geringe Größe machen es zu einem ausgezeichneten System zur Abbildung sowohl zellulärer Prozesse als auch Entwicklung. Hier wird ein Standard-Mikroinjektionsprotokoll angepasst, um die FP-Anwendung in Embryonen zu ermöglichen. Dieser Ansatz ermöglicht die fluoreszierende Bildgebung spezifischer zellulärer Strukturen, ohne dass genetisch kodierte Fluorophore erforderlich sind, wodurch viele genetische Hintergründe für die Bildgebung geöffnet werden. Die Kombination mehrerer Farbstoffe und strategisch ausgewählter, fluoreszierend markierter Proteine kann mehrkanalige Live-Bildgebung eröffnen, die das gesamte Spektrum des sichtbaren Lichts abdeckt.
Kritische Schritte im Protokoll:
Dieses Protokoll verwendet BODIPY 493/503 zur Kennzeichnung von LDs. Dieser Ansatz kann leicht angepasst werden, um andere zelluläre Strukturen zu markieren. Für die anschließende Bildanalyse ist einer der wichtigsten Faktoren das Signal-Rausch-Verhältnis, also die Helligkeit des Farbstoffs im Vergleich zum Hintergrundsignal. Lysosomen wurden erfolgreich abgebildet (LysoTracker Red, 1 mM), ebenso wie Mitochondrien (Mitoview 633, 200 μM), der ER (ER Tracker Green, 10 μM) und Mikrotubuli (SiR-Tubulin, 200 nM in DMSO), wie in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 , Abbildung 5 gezeigt. Darüber hinaus sind Eigelbvesikel autofluoreszierend und geben bei UV-Anregung blaues Licht ab (Bild mit 405 nm als Anregungswellenlänge (Abbildung 6)). Für andere Farbstoffe sollten Sie die Farbstoffkonzentration auf das 100-1.000-fache dessen erhöhen, was für die Färbung kultivierter Zellen erforderlich wäre; Dies ist vergleichbar mit der Konzentration einer Stammlösung, die zu Zellkulturmedien verdünnt würde. Da dieses Protokoll eine Injektion von 100 fL vorsieht und der Drosophila-Embryo in Band18 etwa 9 nL beträgt, werden diese Farbstoffkonzentrationen auf eine interne embryonale Konzentration von unter 1/100 von dem, was in den Zellkulturmedien vorhanden ist, gemittelt. Vorübergehend wird die lokale Konzentration an der Injektionsstelle höher sein, was am relevantesten für FPs ist, die nicht gut diffundieren (d. h. mitochondriale Farbstoffe und SiR-Tubulin). Beginnen Sie für diese FPs mit den empfohlenen hohen Konzentrationen. Wenn ein unerwarteter Tod beobachtet wird, verwässern Sie nacheinander das Zweifache, bis ein akzeptabler Kompromiss zwischen Überleben und Signalstärke erreicht ist.
Bei der gemeinsamen Injektion mehrerer Farbstoffe sollten sich beide Farbstoffe entweder im selben Lösungsmittel befinden oder sowohl die Lösungsmittel als auch die Farbstoffe sollten mit der Mischung kompatibel sein (Alkoholkonzentrationen von mehr als ~ 10% werden nicht empfohlen).
Die Qualität der Nadeln ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, da die Spitze so fein wie möglich sein muss. Andernfalls können Schäden durch die Injektionswunde die spätere Entwicklung des Embryos beeinträchtigen. Da sich handelsübliche Nadelzieher unterscheiden, ist es wichtig, den Vorschlägen des Herstellers zu folgen und mehrere Zugparameter auszuprobieren, bis die gewünschte Form erreicht ist. Es ist wichtig, den Qualitätskontrollschritt 1.1.3 durchzuführen, da die Arbeit mit einer rissigen, gezackten oder großen Nadelspitze die erfolgreiche Injektion erschwert oder sogar unmöglich macht.
Der Embryo muss teilweise ausgetrocknet werden, damit während der Injektion zusätzliche Flüssigkeitsvolumina hinzugefügt werden können. Wenn der Embryo untergetrocknet ist, dringt die Nadel nicht leicht ein, und Zytoplasma spritzt heraus, wenn die Nadel eindringt oder wenn die Lösung injiziert wird. Wenn der Embryo übermäßig ausgetrocknet ist, sieht er entleert aus und entwickelt sich nicht richtig. Die genaue Trocknungszeit hängt von den örtlichen Gegebenheiten, z.B. der Luftfeuchtigkeit, ab und kann sich von Tag zu Tag ändern. Sie muss für jede Sitzung empirisch ermittelt werden.
Die Überlebensfähigkeit des Embryos nach der Mikroinjektion hängt entscheidend von der Qualität der Nadel, der richtigen Austrocknung und der Begrenzung des Injektionsvolumens auf weniger als 1 pL (idealerweise 100 fL) ab. Solange diese Parameter optimiert sind, ist keine signifikante Toxizität erkennbar, wenn die beschriebenen Farbstoffe in den empfohlenen Konzentrationen injiziert werden. Wenn Embryonen die Austrocknungs- und Injektionsschritte überleben, entwickeln sie sich typischerweise erfolgreich zu einer Keimbanderweiterung, mit Ausnahme der Mikrotubuli- und ER-Sonden, die Zellularisierungsdefekte in hohen Konzentrationen verursachten (100 fL Injektion der Stammkonzentration von jedem). Die Tests ergaben keine offensichtlichen Entwicklungsfehler, wenn DMSO, Wasser und Mischungen der beiden in den empfohlenen Volumina injiziert wurden, mit einer Überlebensrate des Embryos durch Keimbandausdehnung von ~ 75% oder mehr. Injektionsvolumina von mehr als 1 ml verursachten Defekte und Embryonen, denen ~ 4 ml Volumina injiziert wurden, die für weniger als 1 Stunde entwickelt wurden. Daher müssen die Injektionsvolumina niedrig gehalten werden, was bedeutet, dass die Farbstoffkonzentrationen hoch sein müssen.
Im Allgemeinen werden Injektionen entlang des seitlichen Randes des Embryos empfohlen, da diese zu den geringsten Schäden führen. Die Injektionsstelle muss jedoch möglicherweise in Abhängigkeit von den diffusiven Eigenschaften der eingesetzten FPs angepasst werden. BODIPY 493/503 und LysoTracker diffundieren schneller über den gesamten Embryo als Lipid Spot 610 (ein weiterer Farbstoff zur Markierung von LDs), während SiR-Tubulin und Mitoview 633 nie vollständig über den Embryo diffundieren (Bildgebung bis zu 7 h nach der Injektion). Daher kann eine Injektion in oder in der Nähe der interessierenden Stelle erforderlich sein. Bei der Injektion in den vorderen oder hinteren Bereich wird eine besonders feine Nadel empfohlen.
Die Bildaufnahme stützt sich auf konfokale Mikroskopie, um kleine Organellen und alle Zytoskelettkomponenten optisch zu schneiden und aufzulösen. Techniken, die die Analyse vieler Bilder erfordern (z. B. STORM oder PALM), funktionieren nicht, da der embryonale Inhalt in Bewegung ist und die Fluorophore nicht für das Photoswitching optimiert sind. Der Epifluoreszenzmikroskopie fehlt die laterale und axiale Auflösung, um die meisten Organellen und kleineren zellulären Strukturen zu erkennen. Aus diesen Gründen wird dringend empfohlen, ein konfokales Mikroskop zu verwenden oder die Lichtblatttechnologie zu verwenden.
Die Reproduzierbarkeit der Bildanalyse hängt stark von konsistenten Bilddaten ab. Für die größten Erfolgsaussichten ist eine Optimierung der Injektionstechnik und Bildaufnahme erforderlich. Durch die Etablierung und Anwendung einer Technik, bei der die interessierenden Farbstoffe, die Injektionsstelle, das Alter des Embryos, das Injektionsvolumen und der Aufnahmeaufbau konsistent sind, werden die robustesten Daten für die Bildanalyse generiert.
Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode
Dieses Protokoll demonstriert eine Methode zur Analyse des Massenflusses von LDs in Embryonen im Spaltstadium unter Verwendung der Partikelbild-Velocimetrie. Der gleiche Ansatz kann für andere Organellen, andere Entwicklungsstadien und andere Analysemethoden verwendet werden. Zum Beispiel zeigt Abbildung 2 eine Analyse von LDs und sauren Organellen, die in den synzytialen Stadien der Embryogenese fließen, sichtbar durch gemeinsame Injektion von BODIPY 493/503 und LysoTracker Red. Eine weitere erfolgreiche Bildgebung der LD-Bewegung in Embryonen bis zu 7 h nach der Befruchtung wurde erreicht; Diese Embryonen behalten die Injektionswunde, können sich aber mehrere Stunden entwickeln.
Daten, die mit diesem Protokoll gesammelt wurden, wurden für die Velocimetrie von Partikelbildern verwendet, aber viele andere Analysetechniken sind verfügbar. Zum Beispiel können Partikelverfolgungsprogramme, wie sie in ImageJ, Imaris oder manueller Verfolgung zu finden sind, verwendet werden, um Geschwindigkeiten und Richtungsabhängigkeiten von sich bewegenden Strukturen zu erhalten. Beachten Sie, dass die meisten solcher Tracking-Software für die Arbeit mit Daten aus planaren Zellkultursystemen entwickelt wurden und sich nicht immer gut an 3D-Strukturen wie den Drosophila-Embryo anpassen. Darüber hinaus müssten für die Erzeugung von Partikelverfolgungsdaten von bester Qualität mehrere Z-Ebenen abgebildet werden. Dies sollte machbar sein, wenn die Bilderfassungszeiten unter ~2 s liegen. Dieser Benchmark sollte auf konfokalen Konfokalsystemen mit rotierenden Scheiben, Gitterlichtplatten und neueren konfokalen Laserscanning-Systemen erreichbar sein. Die Machbarkeit der Partikelverfolgung für reichlich vorhandene Organellen wie LDs, Mitochondrien und Lysosomen ist jedoch gering, da die Menge an positivem Signal in einem Sichtfeld für die derzeitigen Tracking-Methoden zu hoch ist. Die Verfolgung von weniger häufigen Strukturen wie Kernen oder Dottervesikeln kann möglich sein. PIV für die Strömungsanalyse funktioniert gut für LDs und saure Organellen in Spaltungsstadien, da sich beide Organellen frei bewegen. Organellen wie Kerne, ER und Mitochondrien sind an andere zelluläre Strukturen gebunden und bewegen sich daher nicht frei und eignen sich nicht für Softwareanalysen, die freie Bewegung voraussetzen. Der Ermittler sollte die Techniken auswählen, die für die interessierende Organelle am besten geeignet sind.
Während der synzytialen und zellulären Blastoderm-Stadien bewegen sich LDs (sowie einige andere Organellen) entlang radial orientierter Mikrotubuli5. Es ist daher möglich, Querschnittsansichten (wie in Abbildung 5) zu finden, in denen einzelne Mikrotubuli über große Entfernungen im Fokus stehen, was eine Partikelverfolgung in 2D ermöglicht. Da sich diese optischen Ebenen tief im Inneren des Embryos befinden, wird die Gesamtsignalstärke verringert und das Signal-Rausch-Verhältnis reduziert.
Für die Tracking-Analyse kann eine möglichst schnelle Bildgebung entscheidende Details der Bewegung und damit der beweglichen Maschinerie aufdecken. Zum Beispiel ist die Lipid-Tröpfchen-Bewegung eine Mischung aus zwei beweglichen Zuständen, Zeitlupe (~ 200 nm / s; durchschnittliche Verfahrstrecke ~ 100 nm) und schnelle lange Bewegung (~ 450 nm / s; durchschnittliche Reiseentfernung ~ 1.000 nm)19; Wenn also Bilder jede Sekunde oder sogar seltener aufgenommen werden, wird der langsam-kurze Zustand nicht mehr erkennbar. Häufige Bildgebung induziert jedoch auch Fluorophorbleiche und Phototoxizität. Die bildgebenden Bedingungen müssen daher in Abhängigkeit von der genauen Fragestellung, die behandelt werden soll, angepasst werden.
Einschränkungen der Methode
Je nach gewünschtem Farbstoff kann das Verfahren durch die Verträglichkeit zwischen der Farbstofflöslichkeit und der Toxizität der Injektionslösung eingeschränkt werden. Alkohole wie Isopropanol und Ethanol sind aufgrund ihrer niedrigeren Viskosität in einer Nadel schwer zu handhaben und scheinen zelluläre Komponenten zu schädigen und den Embryo abzutöten.
Die Methode ist auch nicht gut geeignet, um die frühesten Schritte in der Embryogenese zu visualisieren, da es 30+ Minuten dauert, um die Embryonen für die Injektion vorzubereiten. Bei Raumtemperatur sind die anfänglichen Zellzyklen des Embryos jeweils nur ~ 10 Minuten lang; Selbst wenn man also in Schritt 5.2.3 ein neu befruchtetes Ei kommissionieren würde, wären die ersten Zellzyklen bereits abgeschlossen, wenn der Embryo für die Bildgebung bereit ist.
Die Beleuchtung mit Licht im UV/Blau-Bereich ist deutlich phototoxischer als bei längeren Wellenlängen. Unter solchen Bedingungen (z. B. nach autofluoreszierenden Dottervesikeln; Abbildung 6) muss man die Bildgebungszeit begrenzen (was zu kürzeren Zeitreihen führt) oder eine geringere Laserleistung verwenden (was zu einem reduzierten Signal-Rausch-Verhältnis führt).
Nach der Zellularisierung neigen Farbstoffe, die an einer bestimmten Stelle injiziert werden, dazu, schlecht zu diffundieren, da sie viele Zellmembranen durchqueren müssen. Dies schränkt den Beobachtungsbereich in späteren Entwicklungsstadien ein.
Die Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden
Die Bewegung von LDs und anderen lipidhaltigen Organellen in frühen Embryonen kann mit genetisch kodierten Fluorophoren, markierungsfreien Techniken und durch die Einführung von FPs visualisiert werden. Letzteres kann durch Permeabilisierung der Vitellinmembran12 oder den hier diskutierten Mikroinjektionsansatz erreicht werden.
Genetisch kodierte Fluorophore sind vielseitige Marker, deren Konzentrationen typischerweise von Embryo zu Embryo hochgradig reproduzierbar sind. Sie haben jedoch geringere Quantenausbeuten und bleichen leichter als FPs. Typischerweise sind sie nur in einer oder zwei getaggten Versionen (z. B. GFP oder mCherry) verfügbar, was die Auswahl einschränkt, welche Strukturen gleichzeitig abgebildet werden können. FPs hingegen existieren oft in einer großen Vielfalt; So stehen beispielsweise verschiedene lipidtröpfchenspezifische Farbstoffe mit Emissionsspektren von Autodot im UV/Blau-Spektrum bis hin zu Lipidtox und LipidSpot 610 im Fernrotspektrum zur Verfügung. FPs können auch direkt auf jeden interessierenden Stamm angewendet werden und erfordern daher keine Dehnungskonstruktion, um beispielsweise den gewünschten Organellenmarker in einen mutierten Stamm von Interesse einzuführen. Dieser Vorteil ist besonders ausgeprägt, wenn mehrere Strukturen gleichzeitig beschriftet werden sollen; Statt zeitaufwändiger Kreuzungen über mehrere Generationen hinweg, kann dies an einem einzigen Tag erreicht werden, indem die relevanten Farbstoffe gemischt und gleichzeitig eingeführt werden. Schließlich, wenn zelluläre Prozesse mit pharmakologischer Hemmung untersucht werden sollen, können Medikamente und Farbstoffe zusammen eingeführt werden.
Markierungsfreie Methoden sind sehr leistungsfähige Ansätze zum Nachweis spezifischer zellulärer Strukturen. Zum Beispiel können LDs in frühen Embryonen spezifisch durch Mikroskopie der dritten harmonischen Generation20 oder durch Femtosekunden-stimulierte Raman-Verlust-Mikroskopie21 nachgewiesen werden. Wie FPs können diese Ansätze in jedem genetischen Hintergrund angewendet werden, und da sie kein Bleichen verursachen, ermöglichen sie möglicherweise eine schnellere Bildaufnahme. Sie sind jedoch typischerweise auf bestimmte Organellen beschränkt und unterstützen daher nicht allein die Multiplex-Bildgebung; Sie erfordern auch spezielle Mikroskope.
Es gibt zwei allgemeine Strategien, um kleine Moleküle in Embryonen einzuführen. Einer ist der hier verwendete Mikroinjektionsansatz; Die andere ist eine chemische (Terpen-) Behandlung zur Permeabilisierung der Vitellinmembran. Der letztgenannte Ansatz12 ist weniger involviert als die Mikroinjektion, aber auch variabler von Embryo zu Embryo. Darüber hinaus ist nach der Permeabilisierung der Schutz durch die Vitellinmembran beeinträchtigt und der eigentliche Embryo ist für das externe Medium zugänglich, was es schwieriger macht, ihn am Leben zu erhalten. Es ist viel weniger wahrscheinlich, dass die Mikroinjektion die Embryonalentwicklung entgleisen lässt als die Permeabilisierung. Eine Permeabilisierung wird jedoch empfohlen, wenn viele Embryonen gleichzeitig überwacht werden müssen, z. B. für Drogenscreening-Zwecke. Um die Bewegung zellulärer Strukturen zu verfolgen und reproduzierbare Bildserien zu erhalten, die für die Bildanalyse geeignet sind, ist die Mikroinjektion die Methode der Wahl.
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Der Drosophila-Embryo ist ein wichtiges Modellsystem zur Untersuchung vieler zellbiologischer und entwicklungsbedingter Prozesse 1,5,6. Die Markierung von Organellen mit fluoreszierenden Proteinen hat wichtige Beiträge zum Verständnis geleistet, wie sich der frühe Embryo entwickelt, wie verschiedene Organellen verkehren und wie ein solcher Handel entwicklungs- und genetisch moduliert wird. Ihre Neigung zur Bleichung und die Herausforderungen bei der Erzeugung von Stämmen, bei denen mehrere Organellen mit unterschiedlichen Farben gekennzeichnet sind, schränken jedoch die Anwendung dieses Ansatzes ein. Der Einsatz von FPs, die durch Mikroinjektion eingeführt werden, löst viele dieser Herausforderungen und kann sogar mit fluoreszierend markierten Proteinen kombiniert werden. Diese Technik ermöglicht die Abbildung mehrerer Organellen, Zellstrukturen und Zytoskelettkomponenten in jedem genetischen Hintergrund. Dadurch können mehrere Genotypen mittels Live-Imaging verglichen werden, so dass die Wirkung von Mutationen auf den Handel mit multiplen Organellen bestimmt werden kann.
Dieses Protokoll demonstriert den FP-Injektionsansatz für Embryonen von Drosophila melanogaster, aber im Prinzip gilt dieser Ansatz für alle Insekteneier, für die Mikroinjektionstechniken etabliert wurden, einschließlich anderer Arten von Drosophila, Grillen22 und Blattläusen23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang und Roger White für ihre Kommentare zum Manuskript. Wir danken Patrick Oakes, Stefano Di Talia und Victoria Deneke für das Teilen ihres Fachwissens zur Durchführung von PIV-Analysen. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health F31 HD100127 (an M. D. K.) und R01 GM102155 (an M. A. W) unterstützt.
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
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