تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة
Summary
في جنين ذبابة الفاكهة المبكر ، تكون العديد من العضيات متحركة. من حيث المبدأ ، يمكن تصويرها مباشرة عبر تحقيقات فلورسنت محددة ، لكن قشر البيض يمنع التطبيق المباشر على الجنين. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مثل هذه المجسات عن طريق الحقن المجهري ، ثم تحليل حركة العضيات السائبة عبر قياس سرعة صورة الجسيمات.
Abstract
أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة هي خلايا كبيرة تحتوي على مجموعة واسعة من العضيات التقليدية والخاصة بالجنين. خلال الساعات الثلاث الأولى من التكوين الجنيني ، تخضع هذه العضيات لحركات دراماتيكية مدعومة بتدفق السيتوبلازم القائم على الأكتين والاتجار المدفوع بالمحرك على طول الأنابيب الدقيقة. إن تطوير العديد من مجسات الفلورسنت الصغيرة الخاصة بالعضيات (FPs) يجعل من الممكن تصور مجموعة واسعة من الهياكل المختلفة المحتوية على الدهون في أي نمط وراثي ، مما يسمح بالتصوير الحي دون الحاجة إلى فلوروفور مشفر وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيفية حقن الأصباغ الحيوية والمجسات الجزيئية في أجنة ذبابة الفاكهة لمراقبة الاتجار بعضيات معينة عن طريق التصوير الحي. ويتضح هذا النهج من خلال وضع علامات على قطرات الدهون (LDs) ومتابعة حركتها السائبة عن طريق قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV). يوفر هذا البروتوكول استراتيجية قابلة لدراسة العضيات الأخرى ، بما في ذلك الليزوزومات والميتوكوندريا وحويصلات صفار البيض و ER ، ولتتبع حركة LDs الفردية على طول الأنابيب الدقيقة. إن استخدام الأصباغ المتاحة تجاريا يجلب فوائد الفصل إلى المناطق البنفسجية / الزرقاء والحمراء البعيدة من الطيف. من خلال الوسم المشترك المتعدد للعضيات و / أو العناصر الخلوية الهيكلية عن طريق الحقن المجهري ، تتوفر جميع الموارد الوراثية في ذبابة الفاكهة لدراسات الاتجار دون الحاجة إلى إدخال بروتينات موسومة بالفلورسنت. على عكس الفلوروفورات المشفرة وراثيا ، والتي لها غلات كمية منخفضة وتبييض بسهولة ، فإن العديد من الأصباغ المتاحة تسمح بالتقاط سريع ومتزامن لعدة قنوات ذات عوائد فوتونية عالية.
Introduction
الأصباغ الحيوية والمجسات الجزيئية هي أدوات قوية لتصوير هياكل خلوية محددة والعضيات الحية. في جنين ذبابة الفاكهة ، تعرض العديد من العضيات المختلفة توطينا مدفوعا بالهيكل الخلوي1،2،3،4 ، لكن تطبيق هذه الجزيئات الصغيرة يمثل تحديا لأن قشر البيض غير منفذ للعديد منها. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخدام مجسات الفلورسنت (FPs) في الأجنة الحية عن طريق الحقن المجهري من أجل الكشف عن الاتجار واسع النطاق بالعضيات. يغطي الإجراء إعداد محلول الحقن ، وجمع البيض وإعداد الأجنة ، والحقن المجهري ، والتصوير ، وتحليل الصور.
إعادة الترتيب المكاني الدراماتيكي للعضيات شائعة في العديد من البويضات الحيوانية والبيض والأجنة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الكبير لهذه الخلايا. في جنين ذبابة الفاكهة ، على سبيل المثال ، تتحرك قطرات الدهون (LDs) وحويصلات صفار البيض نحو مركز الجنين قبل الخلية5. تعتمد هذه الحركة على الأنابيب الدقيقة وتترك منطقة ~ 40 ميكرومتر في جميع أنحاء محيط الجنين مستنفدة من العضيتين. خلال مراحل الانقسام المبكرة ، يتم نقل العديد من العضيات عن طريق تدفقات السيتوبلازم التي تحركها الانقباضات القائمة على الأكتين الميوسين على سطح الجنين6. على الرغم من أن أجنة العديد من الأنواع تظهر عمليات إعادة ترتيب مماثلة ، إلا أن جنين ذبابة الفاكهة مناسب بشكل خاص لمتابعة هذه العمليات عن طريق التصوير لأنه يتطور خارجيا في “درجة حرارة الغرفة” القياسية في المختبر ، وهو شفاف نسبيا ، وصغير بما يكفي ليتناسب مع معظم إعدادات المجهر ، ويمكن التلاعب به باستخدام أدوات وراثية قوية.
بالنسبة لبعض العضيات ، تتوفر البروتينات الموسومة بالفلورسنت التي تضع علامات على هذه الهياكل على وجه التحديد. على سبيل المثال ، LSD-2 (المعروف أيضا باسم dPLIN2) هو بروتين يستهدف في الأجنة LDs7 على وجه التحديد. تتوفر خطوط الذباب التي تحمل إما جينات متحولة قابلة للحث تشفر اندماجا بين بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) و LSD-28 أو فخ جيني يتم فيه إدخال بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) في منطقة ترميز جين LSD-2 الداخلي 9,10. ومع ذلك ، فإن هذا النهج له قيود ، بما في ذلك أن هذه البروتينات الاندماجية لها عوائد كمية منخفضة وتميل إلى التبييض بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون وضع العلامات على هياكل مختلفة متعددة في وقت واحد تحديا: بالنسبة للعديد من العضيات ، يتوفر حاليا نوع واحد فقط من علامات الفلورسنت (غالبا GFP أو mCherry) ، لذلك قد يتطلب تصوير عضيتين في نفس الوقت جينات أو إدخالات جديدة ؛ أيضا ، حتى لو كانت العلامات المتوافقة متوفرة ، فإن إدخالها في سلالة واحدة يمكن أن يتطلب تقاطعات تستغرق وقتا طويلا. كما أنه يجعل استخدام العديد من الموارد الوراثية القوية أقل ملاءمة، على سبيل المثال، إذا كان يجب أن تكون علامتا عضيتين، وبرنامج تشغيل Gal4، وبناء RNAi قابل للتحريض موجودة في نفس الأم.
من حيث المبدأ ، يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام FPs ، بما في ذلك الأصباغ الحيوية (على سبيل المثال ، LysoTracker لوضع علامة على الليزوسومات) ، والمجسات الجزيئية (على سبيل المثال ، SiR-tubulin لتسمية microtubules) ، والجزيئات البيولوجية المصنفة بالفلورسنت (على سبيل المثال ، C12 BODIPY للتحقيق في استقلاب الأحماض الدهنية11). من الاستخدام في الخلايا المستزرعة ، عادة ما يتم التحقق من صحتها جيدا كأدوات قوية لفحص البيولوجيا الخلوية. FPs متعددة الاستخدامات ، ولها خصائص صور فائقة ، ومتوافقة مع البروتينات الفلورية. يمكن خلط أصباغ متعددة وتطبيقها في وقت واحد ، وغالبا ما يكون ذلك مع فوائد الفصل في المناطق البنفسجية / الزرقاء والحمراء البعيدة من الطيف وتحولات ستوكس الصغيرة ، مما يمنع نزيف القناة من خلالها. تسمح تحولات ستوكس الصغيرة بالتقاط قنوات تصوير متعددة في وقت واحد، مما يتيح تتبع العديد من العضيات في وقت واحد. وأخيرا ، يمكن تطبيقها بنفس القدر على وضع العلامات على العضيات في أجنة أنواع ذبابة الفاكهة الأخرى أو حتى الحشرات الأخرى حيث قد لا تتوفر بروتينات موسومة بالفلورسنت.
ومع ذلك ، فإن معظم هذه FPs لا يمكنها اجتياز قشر البيض المتقن لجنين ذبابة الفاكهة . وهو يتألف من خمس طبقات: ثلاث طبقات مشيمية خارجية (كوريون) تمنع التلف الميكانيكي بالإضافة إلى طبقة شمعية تحيط بغشاء الفيتلين الذي يخلق حاجزا كيميائيا12. من أجل البساطة ، سيشار إلى مزيج من الطبقة الشمعية وغشاء vitelline باسم “غشاء vitelline” أدناه. لتجاوز قشر البيض ، يقوم هذا البروتوكول بتكييف نهج الحقن المجهري للأجنة المعمول به لإدخال FPs في جنين ذبابة الفاكهة . يصف البروتوكول كيفية مراقبة التدفق السيتوبلازمي ل LDs في أجنة مرحلة الانقسام. ويشمل إعداد إبر الحقن وأقفاص جمع البيض ، وعملية جمع البيض ، والإزالة الميكانيكية للكوريون. ويتناول كيفية الحقن الدقيق للأجنة وتصويرها وكيفية تحليل التدفق الأكبر ل LDs باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV ، مقتبس من6). ويقدم المشورة بشأن استكشاف الأخطاء وإصلاحها لضمان بقاء الجنين على قيد الحياة وإنشاء أفضل نظام للتصوير. كما نوقشت كيفية تعديل البروتوكول لتصوير LDs و microtubules في وقت واحد أو لتطبيقه على دراسة العضيات الأخرى ، بما في ذلك الليزوسومات والميتوكوندريا وحويصلات صفار البيض والشبكة الإندوبلازمية (ER).
Protocol
Representative Results
Discussion
جنين ذبابة الفاكهة هو نموذج قوي ومناسب لدراسة الأسئلة الأساسية في البيولوجيا الخلوية والكائنات الحية. بساطته النسبية ، وعلم الوراثة القوي ، وصغر حجمه يجعلها نظاما ممتازا لتصوير كل من العمليات الخلوية والتنمية. هنا ، يتم تكييف بروتوكول الحقن المجهري القياسي لتمكين استخدام FP في الأجنة. يسمح هذا النهج بالتصوير الفلوري لهياكل خلوية محددة دون الحاجة إلى فلوروفورات مشفرة وراثيا ، مما يفتح العديد من الخلفيات الجينية للتصوير. يمكن أن يؤدي الجمع بين أصباغ متعددة بالإضافة إلى البروتينات المختارة بشكل استراتيجي ذات العلامات الفلورية إلى فتح تصوير مباشر متعدد القنوات يمتد عبر مجموعة كاملة من الضوء المرئي.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول:
يستخدم هذا البروتوكول BODIPY 493/503 لتسمية LDs. يمكن بسهولة تكييف هذا النهج لوضع علامة على الهياكل الخلوية الأخرى. بالنسبة لتحليل الصور اللاحق ، فإن أحد أهم العوامل هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، أي سطوع الصبغة مقارنة بإشارة الخلفية. تم تصوير الليزوسومات بنجاح (LysoTracker Red ، 1 mM) ، وكذلك الميتوكوندريا (Mitoview 633 ، 200 μM) ، و ER (متعقب ER Green ، 10 μM) ، والأنابيب الدقيقة (SiR tubulin ، 200 nM في DMSO) ، كما هو موضح في الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حويصلات صفار البيض هي ذاتية الفلورسنت وتعطي ضوءا أزرق عند إثارة الأشعة فوق البنفسجية (الصورة باستخدام 405 نانومتر كطول موجي للإثارة (الشكل 6)). بالنسبة للأصباغ الأخرى ، تهدف إلى أن يكون تركيز الصبغة 100-1000x مما هو مطلوب لتلطيخ الخلايا المستزرعة الحية ؛ هذا مشابه لتركيز محلول المخزون الذي سيتم تخفيفه في وسائط زراعة الخلايا. نظرا لأن هذا البروتوكول يدعو إلى حقن 100 fL وجنين ذبابة الفاكهة هو تقريبا 9 nL في الحجم18 ، فإن تركيزات الصبغة هذه ستصل في المتوسط إلى تركيز جنيني داخلي أقل من 1/100th مما هو موجود في وسائط زراعة الخلايا. مؤقتا ، سيكون التركيز المحلي أعلى في موقع الحقن ، وهو الأكثر ملاءمة ل FPs التي لا تنتشر بشكل جيد (أي أصباغ الميتوكوندريا و SiR-tubulin). بالنسبة لهذه FPs ، ابدأ بالتركيزات العالية الموصى بها ؛ إذا لوحظ موت غير متوقع ، فقم بالتخفيف على التوالي مرتين حتى يتم التوصل إلى حل وسط مقبول بين البقاء على قيد الحياة وقوة الإشارة.
عند الحقن المشترك لأصباغ متعددة ، يجب أن تكون كلتا الصبغتين إما في نفس المذيب ، أو يجب أن تكون كل من المذيبات والأصباغ متوافقة مع الخليط (لا ينصح بتركيزات الكحول التي تتجاوز ~ 10٪).
تعد جودة الإبر ضرورية لنجاح هذا الإجراء ، حيث يجب أن يكون الطرف جيدا قدر الإمكان. خلاف ذلك ، يمكن أن يؤدي الضرر الناجم عن جرح الحقن إلى الإضرار بالتطور اللاحق للجنين. نظرا لاختلاف مجتذبات الإبرة التجارية ، من المهم اتباع اقتراحات الشركة المصنعة وتجربة معلمات سحب متعددة حتى يتم تحقيق الشكل المطلوب. من الأهمية بمكان تنفيذ خطوة مراقبة الجودة 1.1.3 لأن العمل مع طرف إبرة متصدع أو خشن أو كبير التجويف سيجعل الحقن الناجح أكثر صعوبة أو حتى مستحيلا.
يحتاج الجنين إلى التجفيف جزئيا بحيث يمكن إضافة كميات إضافية من السائل أثناء الحقن. إذا كان الجنين غير جاف ، فلن تدخل الإبرة بسهولة ، وسوف ينفث السيتوبلازم مع اختراق الإبرة أو عند حقن المحلول. إذا كان الجنين مجففا بشكل مفرط ، فسيبدو مفرغا ولن يتطور بشكل صحيح. يعتمد وقت التجفيف الدقيق على الظروف المحلية ، على سبيل المثال ، رطوبة الهواء ، ويمكن أن يتغير من يوم لآخر. ويجب تحديده تجريبيا لكل دورة.
تعتمد قدرة الجنين على البقاء على قيد الحياة بعد الحقن المجهري بشكل حاسم على جودة الإبرة ، والتجفيف المناسب ، والحد من حجم الحقن إلى أقل من 1 pL (من الناحية المثالية 100 fL). طالما تم تحسين هذه المعلمات ، لا تظهر سمية كبيرة عند حقن الأصباغ الموصوفة بالتركيزات الموصى بها. إذا نجت الأجنة من خطوات التجفيف والحقن ، فإنها عادة ما تتطور بنجاح جيد في امتداد النطاق الجرثومي ، باستثناء مجسات الأنابيب الدقيقة و ER التي تسببت في عيوب الخلوية بمستويات عالية (حقن 100 fL من تركيز المخزون لكل منهما). لم يجد الاختبار أي عيوب تنموية واضحة عندما تم حقن DMSO والماء ومخاليط الاثنين بالكميات الموصى بها ، مع معدل بقاء الجنين من خلال تمديد النطاق الجرثومي بنسبة ~ 75٪ أو أكثر. تسببت أحجام الحقن التي تزيد عن 1 pL في حدوث عيوب وأجنة تم حقنها بأحجام ~ 4 pL تم تطويرها لمدة تقل عن 1 ساعة. لذلك ، يجب أن تبقى أحجام الحقن منخفضة ، مما يعني أن تركيزات الصبغة يجب أن تكون عالية.
بشكل عام ، يوصى بالحقن على طول الحافة الجانبية للجنين لأن ذلك يؤدي إلى أقل ضرر. ومع ذلك ، قد يلزم تعديل موقع الحقن اعتمادا على الخصائص المنتشرة ل FPs المستخدمة. ينتشر BODIPY 493/503 و LysoTracker بشكل أسرع عبر الجنين بأكمله من Lipid Spot 610 (صبغة أخرى لتمييز LDs) ، في حين أن SiR-Tubulin و Mitoview 633 لا ينتشران بالكامل عبر الجنين (التصوير في وقت متأخر من 7 ساعات بعد الحقن). وبالتالي ، قد يكون الحقن في أو بالقرب من موقع الاهتمام ضروريا. عند الحقن في المناطق الأمامية أو الخلفية ، يوصى باستخدام إبرة دقيقة بشكل خاص.
يعتمد الحصول على الصور على الفحص المجهري البؤري لتقسيم العضيات الصغيرة وجميع مكونات الهيكل الخلوي وحلها بصريا. لن تنجح التقنيات التي تتطلب تحليل العديد من الصور (مثل STORM أو PALM) لأن المحتويات الجنينية في حالة حركة ولم يتم تحسين الفلوروفورات للتبديل الضوئي. يفتقر المجهر Epifluorescence إلى الدقة الجانبية والمحورية لصنع معظم العضيات والهياكل الخلوية الأصغر. لهذه الأسباب ، يوصى بشدة باستخدام المجهر البؤري أو استخدام تقنية ورقة الضوء.
تعتمد قابلية تحليل الصور للتكرار بشكل كبير على بيانات التصوير المتسقة. للحصول على أكبر فرصة للنجاح ، يلزم تحسين تقنية الحقن والحصول على الصور. إن إنشاء وممارسة تقنية تكون فيها الصبغة (الصبغات) ذات الأهمية ، وموقع الحقن ، وعمر الجنين ، وحجم الحقن ، وإعداد الاكتساب كلها متسقة ستولد أقوى البيانات لتحليل الصور.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الطريقة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لتحليل التدفق الأكبر ل LDs في أجنة مرحلة الانقسام باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات. يمكن استخدام نفس النهج للعضيات الأخرى ، ومراحل النمو الأخرى ، وطرق التحليل الأخرى. على سبيل المثال، يوضح الشكل 2 تحليل LDs والعضيات الحمضية المتدفقة في المراحل المخلوية من التكوين الجنيني، والتي تم تصورها عن طريق الحقن المشترك BODIPY 493/503 و LysoTracker Red. وقد تحقق مزيد من التصوير الناجح لحركة LD في الأجنة حتى 7 ساعات بعد الإخصاب؛ تحتفظ هذه الأجنة بجرح الحقن ولكنها قادرة على التطور لعدة ساعات.
تم استخدام البيانات التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول لقياس سرعة صورة الجسيمات ، ولكن تتوفر العديد من تقنيات التحليل الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن استخدام برامج تتبع الجسيمات مثل تلك الموجودة في ImageJ أو Imaris أو التتبع اليدوي للحصول على سرعات واتجاهات الهياكل المتحركة. لاحظ أن معظم برامج التتبع هذه مصممة للعمل مع البيانات من أنظمة زراعة الخلايا المستوية ولا تتكيف دائما بشكل جيد مع هياكل 3D مثل جنين ذبابة الفاكهة . وعلاوة على ذلك، ومن أجل توليد أفضل بيانات تتبع الجسيمات جودة، ستحتاج إلى تصوير طائرات Z متعددة؛ يجب أن يكون هذا ممكنا إذا كانت أوقات اكتساب مكدس الصور أقل من ~ 2 ثانية. يجب أن يكون هذا المعيار قابلا للوصول إليه على قرص الدوران ، وورقة الضوء الشبكية ، والأنظمة البؤرية الحديثة للمسح بالليزر. ومع ذلك ، فإن جدوى تتبع الجسيمات للعضيات الوفيرة مثل LDs والميتوكوندريا والليزوسومات منخفضة لأن كمية الإشارة الإيجابية في مجال الرؤية مرتفعة للغاية بالنسبة لطرق التتبع الحالية. قد يكون من الممكن تتبع الهياكل الأقل وفرة مثل النوى أو حويصلات صفار البيض. يعمل PIV لتحليل التدفق بشكل جيد مع LDs والعضيات الحمضية في مراحل الانقسام لأن كلا العضيتين تتحركان بحرية. ترتبط العضيات مثل النوى و ER والميتوكوندريا بهياكل خلوية أخرى وبالتالي لا تتحرك بحرية ولا تتناسب مع تحليل البرامج الذي يفترض حرية الحركة. يجب على المحقق اختيار التقنيات الأنسب للعضية المثيرة للاهتمام.
خلال مرحلتي الأديم الأرومي المخلوي والخلوي ، تتحرك LDs (وكذلك بعض العضيات الأخرى) على طول الأنابيب الدقيقة الموجهة شعاعيا5. لذلك من الممكن العثور على مناظر مقطعية مستعرضة (كما هو الحال في الشكل 5) حيث تكون الأنابيب الدقيقة المفردة في بؤرة التركيز لمسافات طويلة ، مما يسمح بتتبع الجسيمات في 2D. نظرا لأن هذه الطائرات البصرية عميقة داخل الجنين ، فإن قوة الإشارة الإجمالية تتضاءل ، ويتم تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
لتحليل التتبع ، يمكن أن يكشف التصوير في أسرع وقت ممكن عن تفاصيل حاسمة للحركة وبالتالي للآلات المتحركة. على سبيل المثال ، حركة قطرات الدهون هي مزيج من حالتين متحركتين ، حركة بطيئة قصيرة (~ 200 نانومتر / ثانية ؛ متوسط مسافة السفر ~ 100 نانومتر) وحركة سريعة طويلة (~ 450 نانومتر / ثانية ؛ متوسط مسافة السفر ~ 1000 نانومتر)19 ؛ وبالتالي ، إذا تم التقاط الصور كل ثانية أو حتى أقل تكرارا ، تصبح الحالة البطيئة القصيرة غير قابلة للاكتشاف. ومع ذلك ، فإن التصوير المتكرر يحفز أيضا تبييض الفلوروفور والسمية الضوئية. لذلك ، يجب تعديل ظروف التصوير اعتمادا على السؤال الدقيق الذي يجب معالجته.
قيود الطريقة
اعتمادا على الصبغة المطلوبة ، يمكن أن تكون الطريقة محدودة بالتوافق بين ذوبان الصبغة وسمية محلول الحقن. من الصعب التعامل مع الكحوليات مثل الأيزوبروبانول والإيثانول داخل إبرة بسبب انخفاض لزوجتها ويبدو أنها تتلف المكونات الخلوية وتقتل الجنين.
كما أن هذه الطريقة ليست مناسبة تماما لتصور الخطوات الأولى في تكوين الأجنة لأن الأمر يستغرق أكثر من 30 دقيقة لإعداد الأجنة للحقن. في درجة حرارة الغرفة ، تكون دورات الخلية الأولية للجنين ~ 10 دقائق فقط لكل منها ؛ لذلك ، حتى لو اختار المرء بويضة مخصبة حديثا في الخطوة 5.2.3 ، فإن دورات الخلايا القليلة الأولى ستكتمل بالفعل بحلول الوقت الذي يكون فيه الجنين جاهزا للتصوير.
الإضاءة مع الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية / الزرقاء هي أكثر سمية للضوء بكثير من الأطوال الموجية الأطول. في ظل هذه الظروف (على سبيل المثال ، لمتابعة حويصلات صفار البيض ذاتية الفلورسنت ؛ الشكل 6) ، يتعين على المرء الحد من وقت التصوير (مما يؤدي إلى سلسلة زمنية أقصر) أو استخدام طاقة ليزر أقل (مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء).
بعد التجميع الخلوي ، تميل الأصباغ التي يتم حقنها في موقع معين إلى الانتشار بشكل سيئ ، حيث يجب أن تجتاز العديد من أغشية الخلايا. هذا يحد من منطقة الملاحظة في مراحل النمو اللاحقة.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق القائمة / البديلة
يمكن تصور حركة LDs وغيرها من العضيات المحتوية على الدهون في الأجنة المبكرة باستخدام الفلوروفورات المشفرة وراثيا ، والتقنيات الخالية من الملصقات ، وإدخال FPs. يمكن تحقيق هذا الأخير عن طريق اختراق غشاء vitelline12 أو نهج الحقن المجهري الذي تمت مناقشته هنا.
الفلوروفورات المشفرة وراثيا هي علامات متعددة الاستخدامات تكون مستوياتها عادة قابلة للتكرار بشكل كبير من جنين إلى جنين. ومع ذلك ، لديهم عوائد كمية أقل وتبييض بسهولة أكبر من FPs. عادة ، فهي متوفرة فقط في إصدار واحد أو اثنين من الإصدارات الموسومة (على سبيل المثال ، GFP أو mCherry) ، مما يحد من اختيار الهياكل التي يمكن تصويرها في وقت واحد. من ناحية أخرى ، غالبا ما توجد FPs في مجموعة كبيرة ومتنوعة ؛ على سبيل المثال ، تتوفر العديد من الأصباغ الخاصة بقطرات الدهون مع أطياف الانبعاثات من Autodot في طيف الأشعة فوق البنفسجية / الزرقاء إلى Lipidtox و LipidSpot 610 في الطيف الأحمر البعيد. يمكن أيضا تطبيق FPs مباشرة على أي سلالة من الاهتمامات ، وبالتالي لا تتطلب بناء سلالة ، على سبيل المثال ، إدخال علامة العضية المطلوبة في سلالة متحولة من الاهتمام. وهذه الميزة واضحة بشكل خاص عندما يتم تصنيف هياكل متعددة في وقت واحد؛ بدلا من الصلبان المستهلكة للوقت التي تمتد عبر أجيال متعددة ، يمكن تحقيق ذلك في يوم واحد عن طريق خلط الأصباغ ذات الصلة وتقديمها في نفس الوقت. أخيرا ، إذا كان سيتم فحص العمليات الخلوية باستخدام تثبيط دوائي ، فيمكن إدخال الأدوية والأصباغ معا.
الطرق الخالية من الملصقات هي طرق قوية جدا للكشف عن هياكل خلوية محددة. على سبيل المثال ، يمكن اكتشاف LDs على وجه التحديد في الأجنة المبكرة عن طريق المجهر التوافقي الثالث20 أو عن طريق المجهر21 لفقدان الفيمتو ثانية المحفز من الفيمتو ثانية. مثل FPs ، يمكن تطبيق هذه الأساليب في أي خلفية وراثية ، ولأنها لا تسبب التبييض ، فمن المحتمل أن تسمح بالحصول على الصور بشكل أسرع. ومع ذلك ، فإنها تقتصر عادة على عضيات محددة ، وبالتالي لا تدعم في حد ذاتها التصوير متعدد الإرسال ؛ كما أنها تتطلب مجاهر متخصصة.
هناك استراتيجيتان عامتان لإدخال جزيئات صغيرة في الأجنة. أحدهما هو نهج الحقن المجهري المستخدم هنا. والآخر هو العلاج الكيميائي (التربين) لاختراق غشاء الفيتيلين. النهج الأخير12 أقل مشاركة من الحقن المجهري ، ولكنه أيضا أكثر تنوعا من جنين إلى جنين. بالإضافة إلى ذلك ، بعد النفاذية ، يتم اختراق الحماية التي يوفرها غشاء vitelline ويكون الجنين المناسب متاحا للوسط الخارجي ، مما يجعل من الصعب إبقائه على قيد الحياة. الحقن المجهري أقل احتمالا بكثير لإخراج التطور الجنيني عن مساره من النفاذية. ومع ذلك ، يوصى بالنفاذية إذا كان هناك حاجة إلى مراقبة العديد من الأجنة في وقت واحد ، على سبيل المثال ، لأغراض فحص الأدوية. لمتابعة حركة الهياكل الخلوية والحصول على سلسلة صور قابلة للتكرار مناسبة لتحليل الصور ، فإن الحقن المجهري هو الطريقة المفضلة.
أهمية والتطبيقات المحتملة للطريقة في مجالات بحثية محددة
جنين ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي مهم لدراسة العديد من العمليات الخلوية البيولوجية والتنموية1،5،6. وقد ساهم وسم العضيات بالبروتينات الفلورية إسهاما كبيرا في فهم كيفية تطور الجنين المبكر، وكيفية حركة العضيات المختلفة، وكيف يتم تعديل هذا الاتجار من الناحية التنموية والوراثية. ومع ذلك ، فإن ميلها إلى التبييض وتحديات توليد سلالات يتم فيها تصنيف عضيات متعددة بألوان مختلفة تحد من تطبيق هذا النهج. إن استخدام FPs التي يتم إدخالها عن طريق الحقن المجهري يحل العديد من هذه التحديات ويمكن حتى دمجه مع البروتينات الموسومة بالفلورسنت. تسمح هذه التقنية بتصوير عضيات متعددة وهياكل خلايا ومكونات هيكلية خلوية في أي خلفية وراثية. ونتيجة لذلك، يمكن مقارنة العديد من الأنماط الجينية عن طريق التصوير الحي، مما يجعل من الممكن تحديد تأثير الطفرات على الاتجار بالعضيات المتعددة.
يوضح هذا البروتوكول نهج حقن FP لأجنة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، ولكن من حيث المبدأ ، ينطبق هذا النهج على أي بيض حشرات تم إنشاء تقنيات الحقن المجهري لها ، بما في ذلك الأنواع الأخرى من ذبابة الفاكهة ، الصراصير22 ، وحشرات المن23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر باكيني فرومسيري وبراين جينسيك وجينغهونغ (جيمس) تانغ وروجر وايت على تعليقاتهم على المخطوطة. نشكر باتريك أوكس وستيفانو دي تاليا وفيكتوريا دينيك على مشاركة خبراتهم حول كيفية إجراء تحليل PIV. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة F31 HD100127 (إلى M. D. K.) و R01 GM102155 (إلى M. A. W).
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
References
- Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
- Mavor, L. M., et al. Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster. Development. 143 (5), 892-903 (2016).
- Riggs, B., et al. Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11. Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).
- Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics. Cell. 92 (4), 547-557 (1998).
- Welte, M. A. As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).
- Deneke, V. E., et al. Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos. Cell. 177 (4), 925-941 (2019).
- Welte, M. A., et al. Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2. Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).
- Bailey, A. P., et al. Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila. Cell. 163 (2), 340-353 (2015).
- Johnson, M. R., et al. H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos. Elife. 7, 36021 (2018).
- Lowe, N., et al. Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library. Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).
- Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Tran, S. L., Welte, M. A. In-vivo centrifugation of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo collection. CSH Protocols. 2007, (2007).
- Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).
- . The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm (1999)
- Liberzon, A., et al. . OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV – Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).
- Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species. Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance. Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).
- Debarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
- Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy. Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).
- Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus Eggs. Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).
- Le Trionnaire, G., et al. An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).
