Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı
Summary
Burada, kurşun asetat maruziyetinin zebra balığı larvalarında kemik kütlesi değişikliğine neden olduğunu göstermek için alizarin kırmızısı boyamayı kullandık. Bu boyama yöntemi, diğer tehlikeli toksik maddelerin neden olduğu zebra balığı larva kaybındaki kemik kaybının araştırılmasına uyarlanabilir.
Abstract
Kurşun (Pb) maruziyetine bağlı kimyasal olarak indüklenen kemik kaybı, hem insan hem de hayvan iskelet sistemleri üzerinde bir dizi olumsuz etkiyi tetikleyebilir. Bununla birlikte, zebra balığındaki spesifik etkiler ve mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Alizarin kırmızısı, kalsiyum iyonları için yüksek bir afiniteye sahiptir ve kemiği görselleştirmeye ve iskelet mineral kütlesini göstermeye yardımcı olabilir. Bu çalışmada zebra balığı larvalarında kurşun asetat (PbAc) kaynaklı kemik kaybını alizarin kırmızısı boyama yöntemi kullanarak saptamayı amaçladık. Zebra balığı embriyoları, döllenme sonrası 2 ila 120 saat arasında bir dizi PbAc konsantrasyonu (0, 5, 10, 20 mg / L) ile tedavi edildi. Döllenmeden 9 gün sonra larvalar üzerinde tam montajlı iskelet boyama yapıldı ve toplam lekeli alan ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, mineralize dokuların kırmızıyla boyandığını ve lekeli alanın PbAc’a maruz kalma grubunda önemli ölçüde azaldığını ve kemik mineralizasyonunda doza bağlı bir değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu yazıda PbAc’a bağlı kemik defektlerindeki iskelet değişikliklerini araştırmak için bir boyama protokolü sunulmaktadır. Bu yöntem, zebra balığı larvalarında, diğer kimyasalların neden olduğu kemik kaybının tespiti için de kullanılabilir.
Introduction
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, glukokortikoidlere, aromataz inhibitörlerine ve aşırı alkol tüketimine bağlı osteoporozun yaygın olduğunu doğrulamıştır 1,2. Kurşun (Pb) bitkilerde, toprakta ve su ortamlarında bulunan toksik bir metaldir3. Pb’nin insan vücudu üzerindeki olumsuz etkileri çok dikkat çekmiş olsa da, kemik üzerindeki geri dönüşü olmayan etkisinin daha fazla araştırılması gerekmektedir. Kurşun zehirlenmesi, hem gelişmekte olan hem de yetişkin iskeletinde normal yaşam aktivitelerini etkileyen çeşitli patolojik değişikliklere neden olur. Çalışmalar, kronik Pb maruziyeti ile kemik hasarı4 arasında, bozulmuş kemik yapıları5,6, azalmış kemik mineral yoğunluğu ve hatta artmış osteoporoz riski dahil olmak üzere bir ilişki bulmuştur7.
Mineralize doku kemik gücü8 için büyük önem taşır ve kemik mineralizasyon matriks birikimi kemik oluşumunun kritik bir indeksidir9. Alizarin kırmızısı, kalsiyum iyonları için yüksek bir afiniteye sahiptir ve alizarin kırmızısı boyama, kemik oluşumunu değerlendirmek için standart bir prosedürdür10. Bu yönteme göre, mineralize doku kırmızıya boyanırken, diğer tüm dokular şeffaf kalır. Lekeli alan daha sonra dijital görüntü analizi11 ile ölçülür.
Zebra balığı, ilaç keşfi ve hastalık modellerinde yaygın olarak kullanılan önemli bir model organizmadır. Zebra balığı ve insanlarda yapılan genetik çalışmalar, iskelet morfogenezinin altında yatan mekanizmalarda moleküler düzeydebenzerlikler göstermiştir 12. Ayrıca, zebra balıklarının büyük kavramalarında murin modellerinden daha yüksek verimli ilaç veya biyomolekül taraması yapılabilir ve proosteojenik veya osteotoksik moleküllerin mekanik çalışmasını kolaylaştırır13. Toto 10’daki iskeletin diferansiyel boyanması, küçük omurgalılar ve memeli fetüslerinde iskelet displazisinin incelenmesinde sıklıkla kullanılır. Alizarin kırmızısı boyama, zebra balığı larvalarındaki kimyasalların kemik gelişimsel toksisitesini araştırmak için yapıldı. Burada, zebra balığı larvalarında kurşun asetat kaynaklı kemik defektlerini tespit etmek için bir protokolü tanımlamak için kurşunu örnek olarak kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı, kemik metabolik hastalığını incelemek için uygun bir modeldir. Kemirgen modelleriyle karşılaştırıldığında, zebra balığı modellerinin kurulması nispeten hızlıdır ve hastalığın ciddiyetinin ölçülmesi daha kolaydır. Vahşi tip zebra balığı larvalarında, kafa iskeletinin mineralizasyonu 5 dpf’de ve eksenel iskelet 7 dpf15’te gerçekleşir. Böylece, PS, OP, CB ve NC gibi kraniyal kemikler 9 dpf’de iyi gelişmiştir. Larvalar tamamen lekelendikten ve ağa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81872646; 81811540034; 81573173) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S–a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
