Summary

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

Published: December 28, 2021
doi:

Summary

כאן, השתמשנו בכתמים אדומים של אליזרין כדי להראות שחשיפה לאצטט עופרת גורמת לשינוי במסת העצם אצל זחלי דגי זברה. ניתן להתאים שיטת צביעה זו לחקר אובדן עצם באובדן זחלי דגי זברה הנגרמים על ידי חומרים רעילים מסוכנים אחרים.

Abstract

אובדן עצם שנגרם כימית כתוצאה מחשיפה לעופרת (Pb) עלול לגרום למגוון השפעות שליליות על מערכות השלד של בני אדם ובעלי חיים. עם זאת, ההשפעות והמנגנונים הספציפיים בדגי זברה עדיין אינם ברורים. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן והוא יכול לעזור לדמיין את העצם ולהמחיש את מסת המינרלים בשלד. במחקר זה שמנו לנו למטרה לזהות אובדן עצם הנגרם על-ידי אצטט עופרת (PbAc) בזחלים של דגי זברה על-ידי שימוש בכתמים אדומים של אליזרין. עוברי דגי זברה טופלו בסדרה של ריכוזי PbAc (0, 5, 10, 20 מ”ג/ל’) בין 2 ל-120 שעות לאחר ההפריה. צביעת שלד שלם בוצעה על זחלים 9 ימים לאחר ההפריה, והשטח המוכתם הכולל כומת באמצעות תוכנת ImageJ. התוצאות הצביעו על כך שהרקמות המינרליות היו מוכתמות באדום, והאזור המוכתם ירד משמעותית בקבוצת החשיפה ל-PbAc, עם שינוי תלוי מינון במינרליזציה של העצם. מאמר זה מציג פרוטוקול צביעה לחקר שינויים בשלד בפגמים בעצמות הנגרמות על ידי PbAc. השיטה יכולה לשמש גם זחלי דגי זברה לאיתור אובדן עצם הנגרם על ידי כימיקלים אחרים.

Introduction

מחקרים אחרונים אישרו כי אוסטאופורוזיס עקב גלוקוקורטיקואידים, מעכבי ארומטאז וצריכת אלכוהול מופרזת נפוצה 1,2. עופרת (Pb) היא מתכת רעילה המצויה בצמחים, באדמה ובסביבות ימיות3. למרות ההשפעות השליליות של Pb על גוף האדם משכו תשומת לב רבה, ההשפעה הבלתי הפיכה שלה על העצם צריך להיחקר עוד יותר. הרעלת עופרת גורמת למגוון רחב של שינויים פתולוגיים הן בשלד המתפתח והן בשלד הבוגר, המשפיעים על פעילויות החיים הרגילות. מחקרים מצאו קשר בין חשיפה כרונית ל-Pb לבין נזק לעצם4, כולל פגיעה במבני העצם5,6, ירידה בצפיפות המינרלים בעצם ואף סיכון מוגבר לאוסטאופורוזיס7.

לרקמה שעברה מינרליזציה יש חשיבות רבה לחוזק העצם8, ותצהיר מטריצת מינרליזציה של העצם הוא מדד קריטי ליצירת עצם9. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן, וכתמים אדומים של אליזרין הם הליך סטנדרטי להערכת היווצרות עצם10. על פי שיטה זו, רקמה מינרלית מוכתמת באדום, בעוד שכל שאר הרקמות נשארות שקופות. לאחר מכן מכמתים את האזור המוכתם על ידי ניתוח תמונה דיגיטלי11.

דג זברה הוא אורגניזם מודל חשוב הנמצא בשימוש נרחב בגילוי תרופות ובמודלים של מחלות. מחקרים גנטיים בדגי זברה ובבני אדם הראו דמיון במנגנונים הבסיסיים של מורפוגנזה של השלד ברמה המולקולרית12. יתר על כן, בדיקת תרופות או ביו-מולקולות בתפוקה גבוהה אפשרית יותר במצמדים גדולים של דגי זברה מאשר מודלים של מורין, מה שמקל על המחקר המכניסטי של מולקולות פרואוסטאוגניות או אוסטאוטוטוקסיות13. צביעה דיפרנציאלית של השלד בטוטו10 משמשת לעתים קרובות בחקר דיספלסיה של השלד אצל בעלי חוליות קטנים ועוברי יונקים. הכתמה אדומה של אליזרין בוצעה כדי לחקור את הרעילות ההתפתחותית של העצם של כימיקלים בזחלי דגי זברה. כאן, השתמשנו בעופרת כדוגמה לתיאור פרוטוקול לאיתור פגמים בעצמות הנגרמות על ידי אצטט עופרת בזחלי דגי זברה.

Protocol

כל הנהלים לבעלי חיים המפורטים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת Soochow. 1. גידול דגים ואוסף עוברים 14 להאכיל דגים שלוש פעמים בכל יום; ודא שדגי הזברה נשמרים בטמפרטורה של 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של…

Representative Results

צביעה אדומה של אליזרין היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים במינרליזציה של העצם בזחלי דגי זברה. במחקר זה ראינו כי ל-PbAc היו השפעות שליליות על זחלי דגי זברה, כולל מוות, מום, ירידה בקצב הלב וקיצור אורך הגוף. יתר על כן, אזורי השלד המינרלי של זחלי דגי זברה הוערכו כדי לבחון אובדן עצם הנגרם על ידי …

Discussion

דג הזברה הוא מודל מתאים לחקר מחלות מטבוליות של העצם. בהשוואה למודלים של מכרסמים, מודלים של דגי זברה מהירים יחסית להתבססות, ומדידת חומרת המחלה קלה יותר. בזחלי דגי זברה מסוג בר, מינרליזציה של שלד הראש מתרחשת ב-5 dpf והשלד הצירי ב-7 dpf15. לפיכך, עצמות גולגולת כגון PS, OP, CB ו- NC מפותחות היטב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81872646; 81811540034; 81573173) ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפה של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג’יאנגסו (PAPD).

Materials

1 M Tris-HCl (pH=7.5) Solarbio,Beijing,China 21 for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution BBI,Shanghai,China 14 fixing tissues
10x PBS buffer BBI,Shanghai,China 15 for fixing
35% H2O2 Yonghua,Jiangsu,China 8 removing pigment
50 mL Centrifuge tube AKX,Jiangsu,China 4
95% Anhydrous ethanol Enox,Jiangsu,China 2 destaining
Alizarin red (Purity 99.5%) Solarbio,Beijing,China 1 staining
Biochemical incubator Yiheng,Shanghai,China 3 raising zebrafish embryos
Electronic scale Sartorius,Germany 5 weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%) BBI,Shanghai,China 7 storing the stained fish
ImageJ (software) USA 9 digital analysis
KOH (Purity 99.9%) Sigma,America 10 bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) Aladdin,Shanghai,China 11
MgCl2 (Purity 99.9%) Aladdin,Shanghai,China 12 cleaning solution
NIS-Elements F (software) Nikon, Japan 13 observing and taking photos
Pipe AKX, Jiangsu, China 18 removal of embryos and solution
plates (24-well) Corning,America 17 container for staining embryos
plates (6-well) Corning,America 16 container for breeding embryos
Shaking table Beyotime, China 19 mixing the solution
Stereo microscope Nikon,Japan 20 observing and taking photos
Zebrafish Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China 22 experimental animal

References

  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S–a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ding, J., Yan, R., Wang, L., Yang, Q., Zhang, X., Jing, N., Wei, Y., Zhang, H., An, Y. Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (178), e63251, doi:10.3791/63251 (2021).

View Video