כאן, השתמשנו בכתמים אדומים של אליזרין כדי להראות שחשיפה לאצטט עופרת גורמת לשינוי במסת העצם אצל זחלי דגי זברה. ניתן להתאים שיטת צביעה זו לחקר אובדן עצם באובדן זחלי דגי זברה הנגרמים על ידי חומרים רעילים מסוכנים אחרים.
אובדן עצם שנגרם כימית כתוצאה מחשיפה לעופרת (Pb) עלול לגרום למגוון השפעות שליליות על מערכות השלד של בני אדם ובעלי חיים. עם זאת, ההשפעות והמנגנונים הספציפיים בדגי זברה עדיין אינם ברורים. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן והוא יכול לעזור לדמיין את העצם ולהמחיש את מסת המינרלים בשלד. במחקר זה שמנו לנו למטרה לזהות אובדן עצם הנגרם על-ידי אצטט עופרת (PbAc) בזחלים של דגי זברה על-ידי שימוש בכתמים אדומים של אליזרין. עוברי דגי זברה טופלו בסדרה של ריכוזי PbAc (0, 5, 10, 20 מ”ג/ל’) בין 2 ל-120 שעות לאחר ההפריה. צביעת שלד שלם בוצעה על זחלים 9 ימים לאחר ההפריה, והשטח המוכתם הכולל כומת באמצעות תוכנת ImageJ. התוצאות הצביעו על כך שהרקמות המינרליות היו מוכתמות באדום, והאזור המוכתם ירד משמעותית בקבוצת החשיפה ל-PbAc, עם שינוי תלוי מינון במינרליזציה של העצם. מאמר זה מציג פרוטוקול צביעה לחקר שינויים בשלד בפגמים בעצמות הנגרמות על ידי PbAc. השיטה יכולה לשמש גם זחלי דגי זברה לאיתור אובדן עצם הנגרם על ידי כימיקלים אחרים.
מחקרים אחרונים אישרו כי אוסטאופורוזיס עקב גלוקוקורטיקואידים, מעכבי ארומטאז וצריכת אלכוהול מופרזת נפוצה 1,2. עופרת (Pb) היא מתכת רעילה המצויה בצמחים, באדמה ובסביבות ימיות3. למרות ההשפעות השליליות של Pb על גוף האדם משכו תשומת לב רבה, ההשפעה הבלתי הפיכה שלה על העצם צריך להיחקר עוד יותר. הרעלת עופרת גורמת למגוון רחב של שינויים פתולוגיים הן בשלד המתפתח והן בשלד הבוגר, המשפיעים על פעילויות החיים הרגילות. מחקרים מצאו קשר בין חשיפה כרונית ל-Pb לבין נזק לעצם4, כולל פגיעה במבני העצם5,6, ירידה בצפיפות המינרלים בעצם ואף סיכון מוגבר לאוסטאופורוזיס7.
לרקמה שעברה מינרליזציה יש חשיבות רבה לחוזק העצם8, ותצהיר מטריצת מינרליזציה של העצם הוא מדד קריטי ליצירת עצם9. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן, וכתמים אדומים של אליזרין הם הליך סטנדרטי להערכת היווצרות עצם10. על פי שיטה זו, רקמה מינרלית מוכתמת באדום, בעוד שכל שאר הרקמות נשארות שקופות. לאחר מכן מכמתים את האזור המוכתם על ידי ניתוח תמונה דיגיטלי11.
דג זברה הוא אורגניזם מודל חשוב הנמצא בשימוש נרחב בגילוי תרופות ובמודלים של מחלות. מחקרים גנטיים בדגי זברה ובבני אדם הראו דמיון במנגנונים הבסיסיים של מורפוגנזה של השלד ברמה המולקולרית12. יתר על כן, בדיקת תרופות או ביו-מולקולות בתפוקה גבוהה אפשרית יותר במצמדים גדולים של דגי זברה מאשר מודלים של מורין, מה שמקל על המחקר המכניסטי של מולקולות פרואוסטאוגניות או אוסטאוטוטוקסיות13. צביעה דיפרנציאלית של השלד בטוטו10 משמשת לעתים קרובות בחקר דיספלסיה של השלד אצל בעלי חוליות קטנים ועוברי יונקים. הכתמה אדומה של אליזרין בוצעה כדי לחקור את הרעילות ההתפתחותית של העצם של כימיקלים בזחלי דגי זברה. כאן, השתמשנו בעופרת כדוגמה לתיאור פרוטוקול לאיתור פגמים בעצמות הנגרמות על ידי אצטט עופרת בזחלי דגי זברה.
דג הזברה הוא מודל מתאים לחקר מחלות מטבוליות של העצם. בהשוואה למודלים של מכרסמים, מודלים של דגי זברה מהירים יחסית להתבססות, ומדידת חומרת המחלה קלה יותר. בזחלי דגי זברה מסוג בר, מינרליזציה של שלד הראש מתרחשת ב-5 dpf והשלד הצירי ב-7 dpf15. לפיכך, עצמות גולגולת כגון PS, OP, CB ו- NC מפותחות היטב…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81872646; 81811540034; 81573173) ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפה של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג’יאנגסו (PAPD).
1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |