Alizarine rode kleuring gebruiken om chemisch geïnduceerd botverlies bij zebravislarven te detecteren
Summary
Hier hebben we alizarine rode kleuring gebruikt om aan te tonen dat blootstelling aan loodacetaat een botmassaverandering veroorzaakt bij zebravislarven. Deze kleuringsmethode kan worden aangepast aan het onderzoek naar botverlies bij verlies van zebravislarven veroorzaakt door andere gevaarlijke toxische stoffen.
Abstract
Chemisch geïnduceerd botverlies als gevolg van blootstelling aan lood (Pb) kan een reeks nadelige effecten op zowel menselijke als dierlijke skeletsystemen veroorzaken. De specifieke effecten en mechanismen bij zebravissen blijven echter onduidelijk. Alizarine rood heeft een hoge affiniteit voor calciumionen en kan helpen bij het visualiseren van het bot en het illustreren van de minerale massa van het skelet. In deze studie wilden we loodacetaat (PbAc) -geïnduceerd botverlies in zebravislarven detecteren door alizarine rode kleuring te gebruiken. Zebravisembryo’s werden behandeld met een reeks PbAc-concentraties (0, 5, 10, 20 mg / L) tussen 2 en 120 uur na de bevruchting. Whole-mount skeletkleuring werd uitgevoerd op larven 9 dagen na de bevruchting en het totale gekleurde gebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software. De resultaten gaven aan dat de gemineraliseerde weefsels rood gekleurd waren en dat het gekleurde gebied aanzienlijk afnam in de PbAc-blootstellingsgroep, met een dosisafhankelijke verandering in botmineralisatie. Dit artikel presenteert een kleuringsprotocol voor het onderzoeken van skeletveranderingen in PbAc-geïnduceerde botdefecten. De methode kan ook worden gebruikt bij zebravislarven voor de detectie van botverlies veroorzaakt door andere chemicaliën.
Introduction
Recente studies hebben bevestigd dat osteoporose als gevolg van glucocorticoïden, aromataseremmers en overmatig alcoholgebruik vaak voorkomt 1,2. Lood (Pb) is een giftig metaal dat voorkomt in planten, bodem en aquatische omgevingen3. Hoewel de nadelige effecten van Pb op het menselijk lichaam veel aandacht hebben getrokken, moet de onomkeerbare impact ervan op het bot verder worden onderzocht. Loodintoxicatie veroorzaakt een breed scala aan pathologische veranderingen in zowel het zich ontwikkelende als het volwassen skelet, wat van invloed is op normale levensactiviteiten. Studies hebben een verband gevonden tussen chronische Pb-blootstelling en botschade4, waaronder aangetaste botstructuren 5,6, verminderde botmineraaldichtheid en zelfs een verhoogd risico op osteoporose7.
Gemineraliseerd weefsel is van groot belang voor botsterkte8, en botmineralisatiematrixafzetting is een kritische index van botvorming9. Alizarine rood heeft een hoge affiniteit voor calciumionen en alizarine rode kleuring is een standaardprocedure voor het beoordelen van botvorming10. Volgens deze methode wordt gemineraliseerd weefsel rood gekleurd, terwijl al het andere weefsel transparant blijft. Het bevlekte gebied wordt vervolgens gekwantificeerd door digitale beeldanalyse11.
Zebravis is een belangrijk modelorganisme dat veel wordt gebruikt in geneesmiddelenontdekkings- en ziektemodellen. Genetische studies bij zebravissen en mensen hebben overeenkomsten aangetoond in de onderliggende mechanismen van skeletmorfogenese op moleculair niveau12. Bovendien is high-throughput screening van geneesmiddelen of biomolecuulen haalbaarder in grote klauwen zebravissen dan muizenmodellen, waardoor de mechanistische studie van proosteogene of osteotoxische moleculenwordt vergemakkelijkt 13. Differentiële kleuring van het skelet in toto10 wordt vaak gebruikt bij het bestuderen van skeletdysplasie bij kleine gewervelde dieren en zoogdierfoetussen. Alizarine rode kleuring werd uitgevoerd om de botontwikkelingstoxiciteit van chemicaliën in zebravislarven te onderzoeken. Hierin gebruikten we lood als voorbeeld om een protocol te beschrijven voor het detecteren van door loodacetaat geïnduceerde botdefecten bij zebravislarven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zebravis is een geschikt model voor het bestuderen van botmetabolismeziekte. In vergelijking met knaagdiermodellen zijn zebravismodellen relatief snel vast te stellen en is het meten van de ernst van de ziekte eenvoudiger. Bij wild-type zebravislarven treedt mineralisatie van het hoofdskelet op bij 5 dpf en het axiale skelet bij 7 dpf15. Schedelbotten zoals PS, OP, CB en NC zijn dus goed ontwikkeld met 9 dpf. Nadat de larven volledig waren vastgehouden en gebleekt, werden de zachte weefsels ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) en de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S–a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
