Использование красного окрашивания Alizarin для обнаружения химически индуцированной потери костной массы у личинок рыбок данио
Summary
Здесь мы использовали красное окрашивание ализарином, чтобы показать, что воздействие ацетата свинца вызывает изменение костной массы у личинок рыбок данио. Этот метод окрашивания может быть адаптирован для исследования потери костной массы у личинок рыбок данио, вызванной другими опасными токсикантами.
Abstract
Химически индуцированная потеря костной массы из-за воздействия свинца (Pb) может вызвать множество неблагоприятных воздействий как на скелетные системы человека, так и на животных. Тем не менее, конкретные эффекты и механизмы у рыбок данио остаются неясными. Красный ализарин обладает высоким сродством к ионам кальция и может помочь визуализировать кость и проиллюстрировать скелетную минеральную массу. В этом исследовании мы стремились обнаружить потерю костной массы, вызванную ацетатом свинца (PbAc), у личинок рыбок данио с помощью красного окрашивания ализарином. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали серией концентраций PbAc (0, 5, 10, 20 мг/л) между 2 и 120 ч после оплодотворения. Окрашивание скелета цельным креплением проводилось на личинках через 9 дней после оплодотворения, а общая площадь окрашивания была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты показали, что минерализованные ткани были окрашены в красный цвет, а окрашенная область значительно уменьшилась в группе воздействия PbAc с дозозависимым изменением минерализации кости. В данной статье представлен протокол окрашивания для исследования скелетных изменений в PbAc-индуцированных костных дефектах. Метод также может быть использован у личинок рыбок данио для обнаружения потери костной массы, вызванной другими химическими веществами.
Introduction
Недавние исследования подтвердили, что остеопороз из-за глюкокортикоидов, ингибиторов ароматазы и чрезмерного употребления алкоголя распространен 1,2. Свинец (Pb) является токсичным металлом, обнаруженным в растениях, почве и водной среде3. Хотя неблагоприятное воздействие Pb на организм человека привлекло большое внимание, его необратимое влияние на кости нуждается в дальнейшем исследовании. Свинцовая интоксикация вызывает разнообразный спектр патологических изменений как в развивающемся, так и во взрослом скелете, влияя на нормальную жизнедеятельность. Исследования обнаружили связь между хроническим воздействием Pb и повреждением костей4, включая нарушение костных структур 5,6, снижение минеральной плотности кости и даже повышенный риск остеопороза7.
Минерализованная ткань имеет большое значение для прочности кости8, а отложение матрицы минерализации кости является критическим показателем костного образования9. Ализарин красный имеет высокое сродство к ионам кальция, а окрашивание ализариновым красным является стандартной процедурой оценки формирования кости10. Согласно этому методу, минерализованная ткань окрашивается в красный цвет, в то время как вся остальная ткань остается прозрачной. Затем окрашенная область количественно определяется с помощью анализа11 цифрового изображения.
Рыбка данио является важным модельным организмом, широко используемым в моделях открытия лекарств и заболеваний. Генетические исследования на рыбках данио и людях продемонстрировали сходство в основных механизмах морфогенеза скелета на молекулярном уровне12. Кроме того, высокопроизводительный скрининг лекарств или биомолекул более осуществим в больших скоплениях рыбок данио, чем мышиные модели, что облегчает механистическое изучение проостеогенных или остеотоксических молекул13. Дифференциальное окрашивание скелета в toto10 часто используется при изучении дисплазии скелета у мелких позвоночных и плодов млекопитающих. Красное окрашивание ализарином было выполнено для исследования токсичности химических веществ для развития костей у личинок рыбок данио. Здесь мы использовали свинец в качестве примера для описания протокола обнаружения костных дефектов, вызванных ацетатом свинца, у личинок рыбок данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рыбка данио является подходящей моделью для изучения метаболических заболеваний костей. По сравнению с моделями грызунов, модели рыбок данио относительно быстро устанавливаются, а измерение тяжести заболевания проще. У личинок рыбок данио дикого типа минерализация головного скелета…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81872646; 81811540034; 81573173) и Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S–a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
