Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra
Summary
Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.
Abstract
A perda óssea induzida quimicamente devido à exposição ao chumbo (Pb) pode desencadear uma série de impactos adversos nos sistemas esqueléticos humanos e animais. No entanto, os efeitos e mecanismos específicos no peixe-zebra permanecem obscuros. O vermelho de alizarina tem uma alta afinidade por íons de cálcio e pode ajudar a visualizar o osso e ilustrar a massa mineral esquelética. Neste estudo, nosso objetivo foi detectar a perda óssea induzida por acetato de chumbo (PbAc) em larvas de peixe-zebra utilizando a coloração vermelha de alizarina. Embriões de peixe-zebra foram tratados com uma série de concentrações de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 e 120 h após a fertilização. A coloração esquelética de montagem inteira foi realizada em larvas aos 9 dias após a fertilização, e a área total corada foi quantificada usando o software ImageJ. Os resultados indicaram que os tecidos mineralizados foram corados em vermelho, e a área corada diminuiu significativamente no grupo de exposição ao PbAc, com uma mudança dose-dependente na mineralização óssea. Este trabalho apresenta um protocolo de coloração para investigar alterações esqueléticas em defeitos ósseos induzidos por PbAc. O método também pode ser usado em larvas de peixe-zebra para a detecção de perda óssea induzida por outros produtos químicos.
Introduction
Estudos recentes têm confirmado que a osteoporose decorrente de glicocorticoides, inibidores da aromatase e consumo excessivo de álcool é comum 1,2. O chumbo (Pb) é um metal tóxico encontrado em plantas, solo e ambientes aquáticos3. Embora os efeitos adversos do Pb no corpo humano tenham atraído muita atenção, seu impacto irreversível no osso precisa ser investigado mais a fundo. A intoxicação por chumbo causa uma gama diversificada de alterações patológicas no esqueleto em desenvolvimento e no adulto, afetando as atividades normais da vida. Estudos encontraram associação entre exposição crônica ao Pb e danos ósseos4, incluindo estruturas ósseas prejudicadas5,6, redução da densidade mineral óssea e até aumento do risco de osteoporose7.
O tecido mineralizado é de grande importância para a resistência óssea8, e a deposição da matriz de mineralização óssea é um índice crítico de formação óssea9. O vermelho de alizarina tem alta afinidade por íons cálcio, e a coloração vermelha de alizarina é um procedimento padrão para avaliar a formação óssea10. De acordo com este método, o tecido mineralizado é manchado de vermelho, enquanto todos os outros tecidos permanecem transparentes. A área corada é então quantificada por análise de imagem digital11.
O peixe-zebra é um importante organismo modelo amplamente utilizado na descoberta de medicamentos e modelos de doenças. Estudos genéticos em peixes-zebra e humanos demonstraram semelhanças nos mecanismos subjacentes da morfogênese esquelética em nível molecular12. Além disso, o rastreamento de fármacos ou biomoléculas de alto rendimento é mais viável em grandes embreagens de peixe-zebra do que em modelos murinos, facilitando o estudo mecanicista de moléculas proosteogênicas ou osteotóxicas13. A coloração diferencial do esqueleto em toto10 é frequentemente usada no estudo da displasia esquelética em pequenos vertebrados e fetos de mamíferos. A coloração vermelha de alizarina foi realizada para investigar a toxicidade do desenvolvimento ósseo de produtos químicos em larvas de peixe-zebra. Aqui, usamos o chumbo como exemplo para descrever um protocolo para detectar defeitos ósseos induzidos por acetato de chumbo em larvas de peixe-zebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
O peixe-zebra é um modelo adequado para o estudo da doença metabólica óssea. Em comparação com os modelos de roedores, os modelos de peixe-zebra são relativamente rápidos de estabelecer, e a medição da gravidade da doença é mais fácil. Em larvas de peixe-zebra do tipo selvagem, a mineralização do esqueleto da cabeça ocorre a 5 dpf e do esqueleto axial a 7 dpf15. Assim, ossos cranianos como PS, OP, CB e NC estão bem desenvolvidos a 9 dpf. Depois que as larvas foram completamente de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81872646; 81811540034; 81573173) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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