Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven
Summary
Hier haben wir die Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat eine Veränderung der Knochenmasse bei Zebrafischlarven verursacht. Diese Färbemethode kann an die Untersuchung des Knochenverlustes bei Zebrafischlarven angepasst werden, der durch andere gefährliche Giftstoffe induziert wird.
Abstract
Chemisch induzierter Knochenverlust aufgrund von Bleiexposition (Pb) könnte eine Reihe nachteiliger Auswirkungen auf das Skelettsystem von Mensch und Tier haben. Die spezifischen Effekte und Mechanismen im Zebrafisch sind jedoch noch unklar. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen und kann helfen, den Knochen sichtbar zu machen und die skelettale Mineralmasse zu veranschaulichen. In dieser Studie zielten wir darauf ab, Bleiacetat (PbAc)-induzierten Knochenverlust in Zebrafischlarven durch Alizarin-Rotfärbung nachzuweisen. Zebrafischembryonen wurden mit einer Reihe von PbAc-Konzentrationen (0, 5, 10, 20 mg/L) zwischen 2 und 120 h nach der Befruchtung behandelt. Die gesamte Skelettfärbung wurde 9 Tage nach der Befruchtung an Larven durchgeführt, und die gesamte gefärbte Fläche wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die mineralisierten Gewebe rot gefärbt waren und der gefärbte Bereich in der PbAc-Expositions-Gruppe signifikant abnahm, mit einer dosisabhängigen Veränderung der Knochenmineralisierung. Dieser Artikel stellt ein Färbeprotokoll zur Untersuchung von Skelettveränderungen bei PbAc-induzierten Knochendefekten vor. Die Methode kann auch in Zebrafischlarven zum Nachweis von Knochenschwund verwendet werden, der durch andere Chemikalien induziert wird.
Introduction
Neuere Studien haben bestätigt, dass Osteoporose aufgrund von Glukokortikoiden, Aromatasehemmern und übermäßigem Alkoholkonsum häufig ist 1,2. Blei (Pb) ist ein giftiges Metall, das in Pflanzen, Böden und Gewässern vorkommt3. Obwohl die nachteiligen Auswirkungen von Pb auf den menschlichen Körper viel Aufmerksamkeit erregt haben, muss seine irreversible Wirkung auf den Knochen weiter untersucht werden. Bleiintoxikation verursacht eine Vielzahl von pathologischen Veränderungen sowohl im sich entwickelnden als auch im erwachsenen Skelett, die normale Lebensaktivitäten beeinträchtigen. Studien haben einen Zusammenhang zwischen chronischer Pb-Exposition und Knochenschäden gefunden4, einschließlich beeinträchtigter Knochenstrukturen5,6, reduzierter Knochenmineraldichte und sogar erhöhtem Osteoporoserisiko7.
Mineralisiertes Gewebe ist von großer Bedeutung für die Knochenstärke8, und die Ablagerung der Knochenmineralisierungsmatrix ist ein kritischer Index der Knochenbildung9. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen, und die Alizarinrot-Färbung ist ein Standardverfahren zur Beurteilung der Knochenbildung10. Nach dieser Methode wird mineralisiertes Gewebe rot gefärbt, während alles andere Gewebe transparent bleibt. Die gefärbte Fläche wird dann durch digitale Bildanalyse11 quantifiziert.
Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus, der in der Arzneimittelforschung und in Krankheitsmodellen weit verbreitet ist. Genetische Studien an Zebrafischen und Menschen haben Ähnlichkeiten in den zugrunde liegenden Mechanismen der Skelettmorphogenese auf molekularer Ebene gezeigt12. Darüber hinaus ist ein Hochdurchsatz-Wirkstoff- oder Biomolekül-Screening in großen Gelege von Zebrafischen besser durchführbar als in Mausmodellen, was die mechanistische Untersuchung proosteogener oder osteotoxischer Moleküle erleichtert13. Die differentielle Färbung des Skeletts in toto10 wird häufig bei der Untersuchung von Skelettdysplasie bei kleinen Wirbeltieren und Säugetierföten verwendet. Die Alizarin-Rotfärbung wurde durchgeführt, um die Knochenentwicklungstoxizität von Chemikalien in Zebrafischlarven zu untersuchen. Hier haben wir Blei als Beispiel verwendet, um ein Protokoll zum Nachweis von Bleiacetat-induzierten Knochendefekten in Zebrafischlarven zu beschreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Zebrafisch ist ein geeignetes Modell zur Untersuchung von Knochenstoffwechselerkrankungen. Im Vergleich zu Nagetiermodellen sind Zebrafischmodelle relativ schnell zu etablieren, und die Messung der Schwere der Erkrankung ist einfacher. Bei Wildtyp-Zebrafischlarven erfolgt die Mineralisierung des Kopfskeletts bei 5 dpf und des axialen Skeletts bei 7 dpf15. Daher sind Schädelknochen wie PS, OP, CB und NC bei 9 dpf gut entwickelt. Nachdem die Larven vollständig entfärbt und gebleicht waren, wu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) und der Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) unterstützt.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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