Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi
Summary
Islatılmış boncuk testi, hücre farklılaşmasının ve morfogenezinin düzenlenmesini incelemek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında test reaktifinin hedeflenmiş olarak verilmesini içerir. Üç farklı tipte ıslatılmış boncuk hazırlamak ve bunları bir tavuk embriyosunun ara rakamlarına implante etmek için herhangi bir deneysel hayvan modeline uygulanabilir ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Embriyonik gelişim sırasında, şaşırtıcı bir somatik hücre, doku ve organ çeşitliliği oluşturmak için hücre farklılaşmasını düzenleyen çok sayıda genetik program aktive edilir. Bu genetik programların kesin aktivasyonu, hücre kaderini farklı eşiklerde yönlendiren difüzyon molekülleri olan morfojenler tarafından düzenlenir. Genetik aktivasyonun morfogenezi nasıl koordine ettiğini anlamak, gelişim sırasında morfojenler tarafından tetiklenen yerel etkileşimlerin incelenmesini gerektirir. Proteinlere batırılmış boncukların veya embriyonun farklı bölgelerine implante edilmiş ilaçların kullanılması, belirli moleküllerin rakamların ve diğer gelişimsel süreçlerin oluşturulmasındaki rolünün incelenmesini sağlar. Bu deneysel teknik, hücre indüksiyonunun kontrolü, hücre kaderi ve desen oluşumu hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, bu ıslatılmış boncuk testi, diğer embriyonik modellere uygulanabilir son derece güçlü ve değerli bir deneysel araçtır.
Introduction
Embriyonik gelişim sırasında gen ekspresyonunu kontrol eden moleküler mekanizmalardaki atılımlar, hücre kaderinin nasıl belirlendiğini anlamamızı sağlamıştır. Farklı hücre soylarına bağlılık, hücreler transkripsiyon faktörlerinin moleküler ekspresyonuna başladığında ortaya çıkar1. Bu ifade paterni uzay ve zamanda oldukça koordine edilir ve böylece hücrelerin, dokuların ve organların şekillendirilmesini, konumlandırılmasını ve modellenmesini yönlendirir 1,2,3,4,5. Embriyonik indüksiyon, hücrelerin potansiyelini kısıtlayan hiyerarşiler oluşturarak hücrelerin belirli soylara bağlandığı süreçtir, hatta Spemann organizatörü 6,7’de olduğu gibi temel vücut planının oluşturulmasını bile içerir. Blastopore dorsal dudak, konakçı embriyo 8,9’da ikinci bir embriyonik ekseni indükler. Günümüzde, moleküler yaklaşımlarla birleştirilen aşılama ve diğer klasik deneylerin yardımıyla, farklı transkripsiyon faktörlerinin ve büyüme faktörlerinin Spemann organizatörü10’da embriyonik indüksiyonu yönlendirmek için işlev gördüğü bilinmektedir. Bu nedenle, deneysel manipülasyon, embriyogenez sırasında hücre farklılaşmasını, morfogenezi ve modelleme süreçlerini anlamak için önemli bir araçtır.
İlginçtir ki, doku naklinin zor olduğu embriyonik sistemlerde veya indükleyiciler zaten iyi biliniyorsa, taşıyıcılar, hücre farklılaşmasını, morfogenezi ve hatta modellemeyi düzenlemek için molekülleri (örneğin proteinler, kimyasallar, toksinler vb.) Böyle bir taşıyıcı sistem, söz konusu reaktifin etkisini belirlemek veya söz konusu modelin farklılaşmasını yönlendirmek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında herhangi bir deneysel model organizmada belirli bir moleküle batırılmış boncukların implante edilmesini içerir. Örneğin, retinoik asit (RA) ile ıslatılmış boncukları tavuk kanadı uzuv tomurcuğuna implante ederek, Cheryl Tickle ve ark. (1985), RA’nın polarize edici aktivite (ZPA) bölgesinde sonik kirpi ekspresyonunu indüklediğini göstermiştir 11,12. Aynı deneysel strateji, RA’nın basamak gelişimi sırasında ekstremite tomurcuğundaki somitlerin asimetrisini ve hücre ölümünü kontrol ettiğini ve diğer embriyonik uzuv bölgelerinde13,14,15 olduğunu keşfetmek için kullanıldı. Diğer faktörler, esas olarak proteinler (örneğin, fibroblast büyüme faktörleri [FGF], dönüştürücü büyüme faktörü-beta [TGF-ß]), erken embriyoların yanlarında uzuvları ve interdigital bölgede yeni basamakları indüklemek için kullanılmıştır, sırasıyla 16,17,18,19,20,21 . Bu deneyler, moleküllere maruz kalan dokuların veya hücre gruplarının bağlılık veya yeterlilik aşamasını belirlemek için bu tekniğin gücünü ve faydasını kanıtlamaktadır.
Bu protokolde, basamak oluşumu aşamasındaki civciv uzuv, ıslatılmış boncukların nasıl hazırlanacağını ve implante edileceğini adım adım sunmak için deneysel model olarak hizmet etti. Bununla birlikte, bu deneysel araç bu uygulama ile sınırlı değildir, ancak herhangi bir deneysel hayvan modelinde ve indüksiyon, farklılaşma, hücre ölümü ve modellemeyi incelemek için in vitro ve in vivo herhangi bir zaman noktasında kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan deneysel aracın temel avantajı, belirli bir deneysel moleküle batırılmış boncuklara maruz kalma süresini ve yerini kontrol edebilmektir. Doğru konumlandırmayı hassas gelişimsel zamanlama ile birleştirmek, hücre farklılaşma süreçlerini incelemek için muazzam olanaklar sağlar. Bu deneylerin farklılaşmamış dokuda yapılması, hücresel soydaki ilk önemli olayların araştırılmasını sağlar. Örneğin, embriyonik uzuvların interdigital dokusuna TGFß…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, JC-M’ye verilen Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [hibe numaraları IN211117 ve IN213314] ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [hibe numarası 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tarafından desteklenmiştir. JC M-L, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología’dan (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) doktora sonrası burs aldı. Yazarlar Lic’in yardımını takdir ediyor. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM’dan Lucia Brito, bu makalenin hazırlık referanslarında.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction–molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
