Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead
Summary
Il test del tallone imbevuto prevede la consegna mirata del reagente di prova in qualsiasi momento dello sviluppo per studiare la regolazione della differenziazione cellulare e della morfogenesi. Viene presentato un protocollo dettagliato, applicabile a qualsiasi modello animale sperimentale, per preparare tre diversi tipi di perline imbevute e impiantarle nell’interdigit di un embrione di pollo.
Abstract
Una moltitudine di programmi genetici viene attivata durante lo sviluppo embrionale che orchestra la differenziazione cellulare per generare una sorprendente diversità di cellule somatiche, tessuti e organi. L’attivazione precisa di questi programmi genetici è regolata dai morfogeni, molecole diffusibili che dirigono il destino cellulare a diverse soglie. Capire come l’attivazione genetica coordina la morfogenesi richiede lo studio delle interazioni locali innescate dai morfogeni durante lo sviluppo. L’uso di perline imbevute di proteine o farmaci impiantati in regioni distinte dell’embrione consente di studiare il ruolo di molecole specifiche nella creazione di dita e altri processi di sviluppo. Questa tecnica sperimentale fornisce informazioni sul controllo dell’induzione cellulare, del destino cellulare e della formazione del modello. Pertanto, questo test di perline imbevute è uno strumento sperimentale estremamente potente e prezioso applicabile ad altri modelli embrionali.
Introduction
Le scoperte nei meccanismi molecolari che controllano l’espressione genica durante lo sviluppo embrionale ci hanno permesso di capire come viene determinato il destino cellulare. L’impegno verso diverse linee cellulari si verifica una volta che le cellule iniziano l’espressione molecolare dei fattori di trascrizione1. Questo modello di espressione è altamente coordinato nello spazio e nel tempo e quindi dirige la modellazione, il posizionamento e il pattern di cellule, tessuti e organi 1,2,3,4,5. L’induzione embrionale è il processo attraverso il quale le cellule sono impegnate in lignaggi specifici stabilendo gerarchie che limitano le potenzialità delle cellule, che includono anche la generazione del piano corporeo di base come avviene con l’organizzatore spemann 6,7. Il labbro dorsale blastopore induce un secondo asse embrionale in un embrione ospite 8,9. Oggi, con l’aiuto dell’innesto e di altri esperimenti classici combinati con approcci molecolari, è noto che diversi fattori di trascrizione e fattori di crescita funzionano per dirigere l’induzione embrionale nell’organizzatore di Spemann10. Pertanto, la manipolazione sperimentale è uno strumento importante per comprendere la differenziazione cellulare, la morfogenesi e i processi di patterning durante l’embriogenesi.
È interessante notare che, nei sistemi embrionali in cui il trapianto di tessuto è difficile o quando gli induttori sono già ben noti, i vettori vengono utilizzati per fornire molecole (ad esempio, proteine, sostanze chimiche, tossine, ecc.) per regolare la differenziazione cellulare, la morfogenesi e persino il patterning. Uno di questi sistemi di trasporto prevede l’impianto di perline imbevute di una molecola specifica in qualsiasi organismo modello sperimentale in qualsiasi momento di sviluppo per determinare l’effetto di detto reagente o dirigere la differenziazione di detto modello. Ad esempio, impiantando perline imbevute di acido retinoico (RA) nel bocciolo dell’arto dell’ala di pollo, Cheryl Tickle et al. (1985) hanno dimostrato che RA induce l’espressione del riccio sonico nella zona di attività polarizzante (ZPA)11,12. La stessa strategia sperimentale è stata utilizzata per scoprire che l’AR controlla l’asimmetria dei somiti e la morte cellulare nella gemma dell’arto durante lo sviluppo delle dita e in altre regioni embrionali degli arti 13,14,15. Altri fattori, principalmente proteine (ad esempio, fattori di crescita dei fibroblasti [FGF], fattore di crescita trasformante-beta [TGF-ß]) sono stati utilizzati per indurre arti nei fianchi degli embrioni precoci e nuove cifre nella regione interdigitale, rispettivamente 16,17,18,19,20,21 . Questi esperimenti dimostrano il potere e l’utilità di questa tecnica per determinare lo stadio di impegno o competenza dei tessuti o dei gruppi di cellule esposte alle molecole.
In questo protocollo, l’arto del pulcino nella fase di formazione delle dita è servito come modello sperimentale per presentare passo dopo passo come preparare e impiantare le perline imbevute. Tuttavia, questo strumento sperimentale non si limita a questa applicazione, ma può essere sfruttato in qualsiasi modello animale sperimentale e in qualsiasi punto temporale in vitro e in vivo per studiare l’induzione, la differenziazione, la morte cellulare e il patterning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il vantaggio principale dello strumento sperimentale dettagliato in questo protocollo è quello di poter controllare il tempo e la posizione dell’esposizione alle perline imbevute di una determinata molecola sperimentale. La combinazione del corretto posizionamento con tempi di sviluppo precisi offre enormi possibilità per studiare i processi di differenziazione cellulare. L’esecuzione di questi esperimenti nel tessuto indifferenziato consente di indagare i primi eventi cruciali nel lignaggio cellulare. Ad esempio, posi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [numeri di sovvenzione IN211117 e IN213314] e dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [numero di sovvenzione 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] assegnato a JC-M. JC M-L ha ricevuto una borsa di studio post-dottorato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Gli autori apprezzano l’aiuto di Lic. Lucia Brito dell’Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM nella preparazione dei riferimenti di questo manoscritto.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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