تحليل تمايز الخلايا ، والتشكل ، والتنميط أثناء التكوين الجنيني للدجاج باستخدام فحص الخرز المنقوع
Summary
تتضمن مقايسة الخرزة المنقوعة التسليم المستهدف لكاشف الاختبار في أي نقطة زمنية تنموية لدراسة تنظيم تمايز الخلايا وتكوين المورفوجينيا. يتم تقديم بروتوكول مفصل ، ينطبق على أي نموذج حيواني تجريبي ، لإعداد ثلاثة أنواع مختلفة من الخرز المنقوع وزرعها في الأرقام الداخلية لجنين الدجاج.
Abstract
يتم تنشيط العديد من البرامج الجينية أثناء التطور الجنيني الذي ينسق تمايز الخلايا لتوليد تنوع مذهل من الخلايا الجسدية والأنسجة والأعضاء. يتم تنظيم التنشيط الدقيق لهذه البرامج الجينية بواسطة مورفوجينات ، وهي جزيئات قابلة للانتشار توجه مصير الخلية عند عتبات مختلفة. يتطلب فهم كيفية تنسيق التنشيط الجيني للمورفوجينيا دراسة التفاعلات المحلية التي تسببها المورفوجينات أثناء التطور. يتيح استخدام الخرز المنقوع في البروتينات أو الأدوية المزروعة في مناطق متميزة من الجنين دراسة دور جزيئات معينة في إنشاء الأرقام والعمليات التنموية الأخرى. توفر هذه التقنية التجريبية معلومات عن التحكم في تحريض الخلايا ومصير الخلية وتكوين الأنماط. وبالتالي ، فإن اختبار الخرز المنقوع هذا هو أداة تجريبية قوية وقيمة للغاية تنطبق على النماذج الجنينية الأخرى.
Introduction
سمحت لنا الاختراقات في الآليات الجزيئية التي تتحكم في التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني بفهم كيفية تحديد مصير الخلية. يحدث الالتزام بسلالات الخلايا المختلفة بمجرد أن تبدأ الخلايا التعبير الجزيئي لعوامل النسخ1. يتم تنسيق نمط التعبير هذا بشكل كبير في المكان والزمان ، وبالتالي يوجه تشكيل وتحديد المواقع ونمط الخلايا والأنسجة والأعضاء1،2،3،4،5. الحث الجنيني هو العملية التي تلتزم بها الخلايا بسلالات محددة من خلال إنشاء تسلسلات هرمية تقيد إمكانات الخلايا ، والتي تشمل حتى توليد خطة الجسم الأساسية كما يحدث مع منظم سبيمان 6,7. تحفز الشفة الظهرية البلاستوبور محورا جنينيا ثانيا في الجنين المضيف 8,9. اليوم ، بمساعدة التطعيم والتجارب الكلاسيكية الأخرى جنبا إلى جنب مع النهج الجزيئية ، من المعروف أن عوامل النسخ المختلفة وعوامل النمو تعمل على توجيه الحث الجنيني في منظم سبيمان10. وبالتالي ، فإن التلاعب التجريبي هو أداة مهمة لفهم تمايز الخلايا ، وتكوين التشكل ، وعمليات النقش أثناء تكوين الجنين.
ومن المثير للاهتمام ، في الأنظمة الجنينية حيث يكون زرع الأنسجة صعبا أو عندما تكون المحفزات معروفة بالفعل ، يتم استخدام الناقلات لتوصيل الجزيئات (على سبيل المثال ، البروتينات والمواد الكيميائية والسموم ، وما إلى ذلك) لتنظيم تمايز الخلايا ، والتشكل ، وحتى النقش. يتضمن أحد هذه الأنظمة الحاملة زرع حبات غارقة في جزيء معين في أي كائن حي تجريبي في أي نقطة زمنية للتطور لتحديد تأثير الكاشف المذكور أو توجيه تمايز النموذج المذكور. على سبيل المثال ، من خلال زرع حبات منقوعة بحمض الريتينويك (RA) في برعم أطراف جناح الدجاج ، أثبتت Cheryl Tickle et al. (1985) أن RA يحفز التعبير عن القنفذ الصوتي في منطقة نشاط الاستقطاب (ZPA) 11,12. تم استخدام نفس الاستراتيجية التجريبية لاكتشاف أن التهاب المفاصل الروماتويدي يتحكم في عدم تناسق السوميت وموت الخلايا في برعم الأطراف أثناء تطور الأرقام وفي مناطق الأطراف الجنينية الأخرى13،14،15. تم استخدام عوامل أخرى ، وخاصة البروتينات (على سبيل المثال ، عوامل نمو الخلايا الليفية [FGF] ، وتحويل عامل النمو بيتا [TGF-ß]) لتحفيز الأطراف في أجنحة الأجنة المبكرة والأرقام الجديدة في المنطقة بين الرقمية ، على التوالي16،17،18،19،20،21 . تثبت هذه التجارب قوة وفائدة هذه التقنية في تحديد مرحلة التزام أو كفاءة الأنسجة أو مجموعات الخلايا المعرضة للجزيئات.
في هذا البروتوكول ، كان طرف الفرخ في مرحلة تكوين الأرقام بمثابة النموذج التجريبي لتقديم خطوة بخطوة كيفية تحضير وزرع الخرز المنقوع. ومع ذلك ، فإن هذه الأداة التجريبية لا تقتصر على هذا التطبيق ولكن يمكن استغلالها في أي نموذج حيواني تجريبي وفي أي نقطة زمنية في المختبر وفي الجسم الحي لدراسة الحث والتمايز وموت الخلايا والنمط.
Protocol
Representative Results
Discussion
الميزة الرئيسية للأداة التجريبية المفصلة في هذا البروتوكول هي القدرة على التحكم في وقت وموقع التعرض للخرز المنقوع في جزيء تجريبي معين. يوفر الجمع بين تحديد المواقع الصحيح والتوقيت التنموي الدقيق إمكانيات هائلة لدراسة عمليات تمايز الخلايا. يتيح إجراء هذه التجارب في الأنسجة غير المتمايزة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المديرية العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA) – الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك [أرقام المنح IN211117 و IN213314] والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT) [رقم المنحة 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] الممنوحة ل JC-M. حصل JC M-L على زمالة ما بعد الدكتوراه من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). يقدر المؤلفون مساعدة Lic. لوسيا بريتو من معهد التحقيقات الطبية الحيوية، UNAM في إعداد مراجع هذه المخطوطة.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction–molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
