Análise da diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese de frango usando o ensaio de contas encharcadas
Summary
O ensaio de contas encharcada envolve a entrega direcionada de reagente de teste em qualquer ponto de desenvolvimento para estudar a regulação da diferenciação celular e morfogênese. Um protocolo detalhado, aplicável a qualquer modelo animal experimental, para preparar três tipos diferentes de contas encharcadas e implantá-las no interdigit de um embrião de frango é apresentado.
Abstract
Uma infinidade de programas genéticos é ativada durante o desenvolvimento embrionário que orquestra a diferenciação celular para gerar uma diversidade surpreendente de células, tecidos e órgãos somáticos. A ativação precisa desses programas genéticos é regulada por morfogens, moléculas difusíveis que direcionam o destino celular em diferentes limiares. Entender como a ativação genética coordena a morfogênese requer o estudo das interações locais desencadeadas por morfogênicos durante o desenvolvimento. O uso de contas embebidas em proteínas ou drogas implantadas em regiões distintas do embrião permite estudar o papel de moléculas específicas no estabelecimento de dígitos e outros processos de desenvolvimento. Esta técnica experimental fornece informações sobre o controle da indução celular, destino celular e formação de padrões. Assim, este ensaio de contas encharcada é uma ferramenta experimental extremamente poderosa e valiosa aplicável a outros modelos embrionários.
Introduction
Avanços nos mecanismos moleculares que controlam a expressão genética durante o desenvolvimento embrionário nos permitiram entender como o destino celular é determinado. O compromisso com diferentes linhagens celulares ocorre uma vez que as células iniciam a expressão molecular dos fatores de transcrição1. Esse padrão de expressão é altamente coordenado no espaço e no tempo e, assim, direciona a formação, posicionamento e padronização de células, tecidos e órgãos 1,2,3,4,5. A indução embrionária é o processo pelo qual as células estão comprometidas com linhagens específicas, estabelecendo hierarquias que restringem a potencialidade das células, que incluem até mesmo a geração do plano básico do corpo, como ocorre com o organizador spemann 6,7. O lábio dorsal blastopore induz um segundo eixo embrionário em um embrião hospedeiro 8,9. Hoje, com o auxílio do enxerto e outros experimentos clássicos combinados com abordagens moleculares, sabe-se que diferentes fatores de transcrição e fatores de crescimento funcionam para direcionar a indução embrionária no organizadorSpemann 10. Assim, a manipulação experimental é uma ferramenta importante para entender os processos de diferenciação celular, morfogênese e padronização durante a embriogênese.
Curiosamente, em sistemas embrionários onde o transplante de tecido é difícil ou quando os indutores já são bem conhecidos, os portadores são usados para fornecer moléculas (por exemplo, proteínas, produtos químicos, toxinas, etc.) para regular a diferenciação celular, morfogênese e até mesmo a padronização. Um desses sistemas portadores envolve a implantação de contas embebidas em uma molécula específica em qualquer organismo modelo experimental em qualquer ponto de desenvolvimento para determinar o efeito do referido reagente ou direcionar a diferenciação do referido modelo. Por exemplo, ao implantar contas de ácido retinóico (RA) embebidas no broto do membro da asa de frango, Cheryl Tickle et al. (1985) demonstraram que a RA induz a expressão de ouriço sônico na zona de atividade polarizadora (ZPA)11,12. A mesma estratégia experimental foi usada para descobrir que a RA controla a assimetria de somites e morte celular no broto do membro durante o desenvolvimento de dígitos e em outras regiões embrionárias do membro 13,14,15. Outros fatores, principalmente proteínas (por exemplo, fatores de crescimento do fibroblasto [FGF], transformando fator de crescimento-beta [TGF-ß]) têm sido usados para induzir membros nos flancos dos embriões precoces e novos dígitos na região interdigital, respectivamente 16,17,18,19,20,21 . Esses experimentos evidenciam o poder e a utilidade dessa técnica para determinar o estágio de comprometimento ou competência de tecidos ou grupos de células expostas às moléculas.
Neste protocolo, o membro pintinho na fase de formação de dígitos serviu como modelo experimental para apresentar passo a passo como preparar e implantar as contas encharcadas. No entanto, esta ferramenta experimental não se limita a esta aplicação, mas pode ser explorada em qualquer modelo animal experimental e em qualquer ponto de tempo in vitro e in vivo para estudar indução, diferenciação, morte celular e padronização.
Protocol
Representative Results
Discussion
A principal vantagem da ferramenta experimental detalhada neste protocolo é ser capaz de controlar a hora e a localização da exposição a contas encharcadas em uma determinada molécula experimental. Combinar o posicionamento correto com o timing preciso do desenvolvimento oferece enormes possibilidades de estudar processos de diferenciação celular. Realizar esses experimentos em tecidos indiferenciados permite investigar os primeiros eventos cruciais na linhagem celular. Por exemplo, colocar uma conta encharcada d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvenção IN211117 e IN213314] e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [concessão número 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] concedida ao JC-M. JC M-L recebeu uma bolsa de pós-doutorado do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Os autores agradecem a ajuda de Lic. Lucia Brito, do Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM, nas referências de preparação deste manuscrito.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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