Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay
Summary
De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.
Abstract
Een veelheid aan genetische programma’s wordt geactiveerd tijdens de embryonale ontwikkeling die celdifferentiatie orkestreert om een verbazingwekkende diversiteit aan somatische cellen, weefsels en organen te genereren. De precieze activering van deze genetische programma’s wordt gereguleerd door morfogenen, diffuusibele moleculen die het lot van cellen op verschillende drempels sturen. Begrijpen hoe genetische activering morfogenese coördineert, vereist de studie van lokale interacties die tijdens de ontwikkeling door morfogenen worden geactiveerd. Het gebruik van kralen gedrenkt in eiwitten of geneesmiddelen die in verschillende regio’s van het embryo zijn geïmplanteerd, maakt het mogelijk om de rol van specifieke moleculen bij het vaststellen van cijfers en andere ontwikkelingsprocessen te bestuderen. Deze experimentele techniek geeft informatie over de controle van celinductie, cel lot en patroonvorming. Deze geweekte kraaltest is dus een uiterst krachtig en waardevol experimenteel hulpmiddel dat van toepassing is op andere embryonale modellen.
Introduction
Doorbraken in de moleculaire mechanismen die genexpressie tijdens de embryonale ontwikkeling regelen, hebben ons in staat gesteld te begrijpen hoe het lot van cellen wordt bepaald. Toewijding aan verschillende cellijnen vindt plaats zodra cellen beginnen met de moleculaire expressie van transcriptiefactoren1. Dit expressiepatroon is sterk gecoördineerd in ruimte en tijd en stuurt daardoor de vorming, positionering en patroonvorming van cellen, weefsels en organen 1,2,3,4,5. Embryonale inductie is het proces waarbij cellen worden toegewijd aan specifieke afstammingslijnen door hiërarchieën vast te stellen die de potentialiteit van cellen beperken, waaronder zelfs het genereren van het basislichaamsplan zoals gebeurt met de Spemann-organisator 6,7. De blastopore dorsale lip induceert een tweede embryonale as in een gastheerembryo 8,9. Tegenwoordig is het, met behulp van enten en andere klassieke experimenten in combinatie met moleculaire benaderingen, bekend dat verschillende transcriptiefactoren en groeifactoren functioneren om embryonale inductie in de Spemann-organisator10 te sturen. Experimentele manipulatie is dus een belangrijk hulpmiddel om celdifferentiatie, morfogenese en patroonprocessen tijdens embryogenese te begrijpen.
Interessant is dat in embryonale systemen waar weefseltransplantatie moeilijk is of wanneer de inductoren al bekend zijn, dragers worden gebruikt om moleculen af te leveren (bijv. Eiwitten, chemicaliën, toxines, enz.) om celdifferentiatie, morfogenese en zelfs patronen te reguleren. Een dergelijk dragersysteem omvat het implanteren van kralen gedrenkt in een specifiek molecuul in een experimenteel modelorganisme op elk ontwikkelingstijdpunt om het effect van het genoemde reagens te bepalen of de differentiatie van het genoemde model te sturen. Bijvoorbeeld, door retinoïnezuur (RA) -gedrenkte kralen in de knop van de kippenvleugel ledemaat te implanteren, toonden Cheryl Tickle et al. (1985) aan dat RA de expressie van sonische egel induceert in de zone van polariserende activiteit (ZPA) 11,12. Dezelfde experimentele strategie werd gebruikt om te ontdekken dat RA de asymmetrie van somites en celdood in de ledemaatknop regelt tijdens de ontwikkeling van cijfers en in andere embryonale ledemaatgebieden 13,14,15. Andere factoren, voornamelijk eiwitten (bijv. Fibroblastgroeifactoren [FGF], transformerende groeifactor-bèta [TGF-ß]) zijn gebruikt om ledematen in de flanken van vroege embryo’s en nieuwe cijfers in het interdigitale gebied te induceren, respectievelijk 16,17,18,19,20,21 . Deze experimenten bewijzen de kracht en het nut van deze techniek voor het bepalen van het stadium van toewijding of competentie van weefsels of groepen cellen die aan de moleculen worden blootgesteld.
In dit protocol diende de kuikenpoot in het stadium van cijfervorming als het experimentele model om stap voor stap te presenteren hoe de geweekte kralen moeten worden voorbereid en geïmplanteerd. Deze experimentele tool is echter niet beperkt tot deze toepassing, maar kan worden gebruikt in elk experimenteel diermodel en elk tijdspunt in vitro en in vivo om inductie, differentiatie, celdood en patroonvorming te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belangrijkste voordeel van de experimentele tool die in dit protocol wordt beschreven, is de mogelijkheid om de tijd en locatie van de blootstelling aan kralen gedrenkt in een bepaald experimenteel molecuul te regelen. Het combineren van de juiste positionering met een nauwkeurige ontwikkelingstiming biedt enorme mogelijkheden om celdifferentiatieprocessen te bestuderen. Het uitvoeren van deze experimenten in ongedifferentieerd weefsel maakt het mogelijk om de eerste cruciale gebeurtenissen in cellulaire afstamming t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [subsidienummers IN211117 en IN213314] en Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [subsidienummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] toegekend aan JC-M. JC M-L ontving een postdoctoraal mandaat van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). De auteurs waarderen de hulp van Lic. Lucia Brito van Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM in de voorbereiding referenties van dit manuscript.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction–molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
