ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים
Summary
בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.
Abstract
מספר רב של תוכניות גנטיות מופעל במהלך ההתפתחות העוברית אשר מתזמר את התמיינות התאים כדי ליצור מגוון מדהים של תאים, רקמות ואיברים סומטיים. ההפעלה המדויקת של תוכניות גנטיות אלה מווסתת על ידי מורפוג’נים, מולקולות מפוזרות המכוונות את גורל התא לסף שונה. הבנת האופן שבו הפעלה גנטית מתאמת מורפוגנזה דורשת מחקר של אינטראקציות מקומיות המופעלות על ידי מורפוגנס במהלך ההתפתחות. השימוש בחרוזים ספוגים בחלבונים או בתרופות המושתלים באזורים מובחנים של העובר מאפשר לחקור את תפקידן של מולקולות ספציפיות בביסוס ספרות ותהליכי התפתחות אחרים. טכניקה ניסיונית זו מספקת מידע על השליטה באינדוקציה של התא, בגורל התא ובהיווצרות תבניות. לפיכך, בדיקת חרוזים ספוגה זו היא כלי ניסיוני רב עוצמה ובעל ערך החל על מודלים עובריים אחרים.
Introduction
פריצות דרך במנגנונים המולקולריים השולטים בביטוי גנים במהלך ההתפתחות העוברית אפשרו לנו להבין כיצד נקבע גורל התא. מחויבות לשושלות תאים שונות מתרחשת ברגע שהתאים מתחילים בביטוי המולקולרי של גורמי שעתוק1. תבנית ביטוי זו מתואמת מאוד במרחב ובזמן ובכך מכוונת את העיצוב, המיקום והדפוס של תאים, רקמות ואיברים 1,2,3,4,5. אינדוקציה עוברית היא התהליך שבו תאים מחויבים לשושלות ספציפיות על ידי יצירת היררכיות המגבילות את הפוטנציאל של התאים, הכוללות אף את יצירת תוכנית הגוף הבסיסית כפי שקורה עם מארגן Spemann 6,7. השפה הגבית של בלסטופור גורמת לציר עוברי שני בעובר מארח 8,9. כיום, בעזרת השתלה וניסויים קלאסיים אחרים בשילוב עם גישות מולקולריות, ידוע כי גורמי שעתוק וגורמי גדילה שונים מתפקדים כדי לכוון אינדוקציה עוברית במארגן Spemann10. לפיכך, מניפולציה ניסיונית היא כלי חשוב להבנת התמיינות תאים, מורפוגנזה ותהליכי דפוס במהלך יצירת עוברים.
באופן מעניין, במערכות עובריות שבהן השתלת רקמות קשה או כאשר הגורמים כבר ידועים היטב, נשאים משמשים להעברת מולקולות (למשל, חלבונים, כימיקלים, רעלנים וכו’) כדי לווסת התמיינות תאים, מורפוגנזה ואפילו דפוסים. מערכת נשאים אחת כזו כוללת השתלת חרוזים ספוגים במולקולה מסוימת בכל אורגניזם מודל ניסיוני בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לקבוע את השפעתו של המגיב האמור או לכוון את ההבחנה של המודל האמור. לדוגמה, על ידי השתלת חרוזים ספוגי חומצה רטינואית (RA) בניצן כנף הגפיים של העוף, Cheryl Tickle et al. (1985) הראו כי RA משרה ביטוי של קיפוד קולי באזור פעילות הקיטוב (ZPA)11,12. אותה אסטרטגיה ניסיונית שימשה כדי לגלות כי RA שולט באסימטריה של סומיטים ומוות תאי בניצן הגפיים במהלך התפתחות ספרות ובאזורי גפיים עובריים אחרים 13,14,15. גורמים אחרים, בעיקר חלבונים (למשל, גורמי גדילה פיברובלסטים [FGF], המשנים את גורם הגדילה-בטא [TGF-ß]) שימשו להשראת גפיים באגפי העוברים המוקדמים ולספרות חדשות באזור הבין-דיגיטלי, בהתאמה 16,17,18,18,19,20,21 . ניסויים אלה מעידים על העוצמה והתועלת של טכניקה זו לקביעת שלב המחויבות או היכולת של רקמות או קבוצות של תאים שנחשפו למולקולות.
בפרוטוקול זה, איבר האפרוח בשלב היווצרות הספרות שימש כמודל הניסויי להצגת שלב אחר שלב כיצד להכין ולהשתיל את החרוזים הספוגים. עם זאת, כלי ניסיוני זה אינו מוגבל ליישום זה, אלא ניתן לנצלו בכל מודל של בעלי חיים ניסיוניים ובכל נקודת זמן במבחנה וב – in vivo כדי לחקור אינדוקציה, התמיינות, מוות תאי ודפוס.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון העיקרי של הכלי הניסויי המפורט בפרוטוקול זה הוא היכולת לשלוט בזמן ובמיקום של החשיפה לחרוזים הספוגים במולקולה ניסיונית נתונה. שילוב המיקום הנכון עם תזמון התפתחותי מדויק מספק אפשרויות עצומות לחקור תהליכי התמיינות תאים. ביצוע ניסויים אלה ברקמות לא מובחנות מאפשר לחקור את האירועים המכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ה-Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [מספרי מענקים IN211117 ו-IN213314] ו-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [מענק מספר 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] שהוענק ל-JC-M. JC M-L קיבל מלגת פוסט-דוקטורט מה-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). המחברים מעריכים את עזרתו של ליק. לוצ’יה בריטו מהמכון להשקעות ביומדיקס, UNAM בהפניות ההכנה של כתב יד זה.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
- Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
- Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
- Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
- Gurdon, J. B. Embryonic induction–molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
- Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
- Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
- Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
- Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
- Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
- Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
- Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
- Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
- Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
- Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
- Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
- Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
- Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).
