Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese
Summary
Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo’s maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo’s gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.
Abstract
Postimplantatie embryokweekmethoden van zoogdieren zijn over het algemeen inefficiënt en beperkt tot korte perioden na dissectie uit de baarmoeder. Er zijn onlangs platforms ontwikkeld voor zeer robuuste en langdurige ex utero-kweek van muizenembryo’s vanaf ei-cilinderstadia tot gevorderde organogenese. Deze platforms maken een geschikte en getrouwe ontwikkeling van pregastruerende embryo’s (E5.5) mogelijk tot het stadium van de vorming van de achterpoten (E11). Late gastrulatende embryo’s (E7.5) worden in deze omgevingen gekweekt in roterende flessen, terwijl uitgebreide kweek uit pregastrulatiestadia (E5.5 of E6.5) een combinatie van statische en roterende flesculturen vereist. Bovendien zijn gevoelige regulatie van O2 – en CO2-concentratie , gasdruk, glucosespiegels en het gebruik van een specifiek ex utero kweekmedium van cruciaal belang voor een goede embryo-ontwikkeling. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor uitgebreide ex utero muis embryokweek gegeven. Het vermogen om normale muizenembryo’s ex utero te laten groeien van gastrulatie tot organogenese is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van het effect van verschillende experimentele verstoringen tijdens de embryonale ontwikkeling.
Introduction
Intra-uteriene ontwikkeling van het zoogdierembryo heeft de studie van de vroege stadia van postimplantatieontwikkeling beperkt1,2. De ontoegankelijkheid van het zich ontwikkelende embryo belemmert het begrip van belangrijke ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden nadat het embryo zich in de baarmoeder heeft geïmplanteerd, zoals de vaststelling van het dierlijke lichaamsplan, specificatie van de kiemlagen of de vorming van weefsels en organen. Bovendien maakt de zeer kleine omvang van het vroege postimplanteerde embryo het moeilijk om te observeren door intravitale beeldvorming in utero vóór E103. Het onvermogen om levende embryo’s in deze stadia te observeren en te manipuleren heeft de studie van vroege postimplantatie-embryogenese beperkt tot momentopnamen tijdens de ontwikkeling.
Protocollen voor in vitro kweek van pre-implantatie zoogdierembryo’s zijn goed ingeburgerd, betrouwbaar en worden regelmatig gebruikt4. Niettemin hadden pogingen om ex utero-kweeksystemen op te zetten die in staat zijn een goede postimplantatie-embryogroei bij zoogdieren te ondersteunen, beperkt succes5. Al meer dan een eeuw wordt een verscheidenheid aan kweektechnieken voorgesteld, voornamelijk door het kweken van de embryo’s in conventionele statische platen6,7,8 of roterende flessen (rolculturen)5,9,10. Deze platforms bleken nuttig bij het uitbreiden van de kennis over de ontwikkeling van zoogdieren na implantatie11,12, ondanks het feit dat ze zeer inefficiënt waren voor normale embryooverleving en beperkt waren tot korte perioden. De embryo’s begonnen al 24-48 uur na kweekinitiatie ontwikkelingsachterstand en morfologische anomalieën te vertonen.
Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving voor het opzetten van het ex utero embryokweeksysteem dat een continue ontwikkeling mogelijk maakt van pregastrulatie tot gevorderde organogenesestadia gedurende maximaal zes dagen postimplantatieontwikkeling13. Dit artikel beschrijft het verbeterde rollerkweekprotocol dat de groei van E7.5-embryo’s (neurale plaat en headfold-stage) ondersteunt tot het vormingsstadium van de achterpoten (~ E11) en de uitgebreide kweek van E5.5 / E6.5 door cultuur te combineren op statische platen en rolkweekplatforms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierin gepresenteerde kweekprotocol kan een goede en continue ontwikkeling van muizenembryo ex utero gedurende maximaal zes dagen ondersteunen, van E5.5 tot E11. Voorheen konden embryo’s in deze ontwikkelingsstadia zich normaal in cultuur slechts gedurende korte perioden (tot 48 uur) ontwikkelen15. De koppeling van de gasregelmodule aan de rolkweekincubator voor nauwkeurige controle van de zuurstofconcentratie en hyperbare gasdruk is van cruciaal belang voor de juiste muizenembryocult…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Pascal en Ilana Mantoux; Europese Onderzoeksraad (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) hoogleraarschap, BSF, Helen en Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen en Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, het Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella en Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
