خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم
Summary
تسمح المنصة المحسنة لزراعة الأجنة بأكملها بالتطور المستمر والقوي خارج الرحم لأجنة الفئران بعد الزرع لمدة تصل إلى ستة أيام ، من مراحل ما قبل المعدة حتى التكوين العضوي المتقدم. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء القياسي لزراعة الأجنة الناجحة باستخدام لوحات ثابتة وأنظمة زجاجات دوارة.
Abstract
كانت طرق زراعة أجنة الثدييات بعد الزرع غير فعالة بشكل عام وتقتصر على فترات قصيرة بعد تشريح الرحم. تم تطوير منصات مؤخرا لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم القوية والمطولة للغاية من مراحل أسطوانة البيض حتى التكوين العضوي المتقدم. تتيح هذه المنصات التطور المناسب والأمين للأجنة قبل المعدة (E5.5) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (E11). تزرع الأجنة المتأخرة في المعدة (E7.5) في زجاجات دوارة في هذه الإعدادات ، في حين أن الثقافة الموسعة من مراحل ما قبل المعدة (E5.5 أو E6.5) تتطلب مزيجا من مزارع الزجاجات الثابتة والدوارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنظيم الحساس لتركيز O2 و CO2 ، وضغط الغاز ، ومستويات الجلوكوز ، واستخدام وسط معين خارج الرحم أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين السليم. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم الموسعة. تمثل القدرة على نمو أجنة الفئران الطبيعية خارج الرحم من المعدة إلى التكوين العضوي أداة قيمة لتوصيف تأثير الاضطرابات التجريبية المختلفة أثناء التطور الجنيني.
Introduction
وقد حد التطور داخل الرحم لجنين الثدييات من دراسة المراحل المبكرة من تطور ما بعد الزرع1,2. إن عدم إمكانية الوصول إلى الجنين النامي يعيق فهم العمليات التنموية الرئيسية التي تحدث بعد زرع الجنين في الرحم ، مثل إنشاء خطة جسم الحيوان ، أو مواصفات الطبقات الجرثومية ، أو تكوين الأنسجة والأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن الحجم الصغير جدا للجنين المبكر بعد الزرع يجعل من الصعب ملاحظته عن طريق التصوير داخل الجسم في الرحم قبل E103. إن عدم القدرة على مراقبة الأجنة الحية ومعالجتها في هذه المراحل قد حد من دراسة التكوين المبكر للأجنة بعد الزرع إلى لقطات أثناء النمو.
بروتوكولات الاستزراع المختبري لأجنة الثدييات قبل الزرع راسخة وموثوقة وتستخدم بانتظام4. ومع ذلك، فإن محاولات إنشاء أنظمة استزراع خارج الرحم قادرة على دعم نمو جنين الثدييات السليم بعد الزرع حققت نجاحا محدودا5. تم اقتراح مجموعة متنوعة من تقنيات الاستزراع لأكثر من قرن من الزمان ، وذلك أساسا عن طريق زراعة الأجنة في لوحات ثابتة تقليدية 6،7،8 أو زجاجات دوارة (مزارع الأسطوانة) 5،9،10. أثبتت هذه المنصات فائدتها في توسيع المعرفة حول تطور الثدييات بعد الزرع11،12 ، على الرغم من كونها غير فعالة للغاية لبقاء الجنين الطبيعي وتقتصر على فترات قصيرة. بدأت الأجنة في إظهار التخلف التنموي والشذوذ المورفولوجي في وقت مبكر من 24-48 ساعة بعد بدء الثقافة.
تقدم هذه الدراسة وصفا مفصلا لإعداد نظام زراعة الأجنة خارج الرحم الذي يسمح بالتطور المستمر من مرحلة ما قبل المعدة إلى مراحل التكوين العضوي المتقدمة على مدى ما يصل إلى ستة أيام من تطور ما بعد الزرع13. تصف هذه الورقة بروتوكول زراعة الأسطوانة المحسن الذي يدعم نمو أجنة E7.5 (الصفيحة العصبية ومرحلة طي الرأس) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (~ E11) والثقافة الموسعة من E5.5 / E6.5 من خلال الجمع بين الثقافة على لوحات ثابتة ومنصات زراعة الأسطوانة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن لبروتوكول الاستزراع المقدم هنا الحفاظ على التطور السليم والمستمر لجنين الفئران خارج الرحم لمدة تصل إلى ستة أيام ، من E5.5 إلى E11. في السابق، كانت الأجنة في مراحل النمو هذه تتطور بشكل طبيعي في الثقافة فقط لفترات قصيرة (تصل إلى 48 ساعة)15. يعد اقتران وحدة تنظيم الغاز بحاضنة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل باسكال وإيلانا مانتو. مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety) ؛ مجلس البحوث الطبية لمضيفات الطيران (FAMRI) ؛ أستاذية الصندوق الإسرائيلي لأبحاث السرطان (ICRF) ، BSF ، معهد هيلين ومارتن كيميل لأبحاث الخلايا الجذعية ، جائزة هيلين ومارتن كيميل للتحقيق المبتكر ؛ مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، مينيرفا، معهد شيرمان للكيمياء الطبية، مركز نيلا وليون بينوزيو للأمراض العصبية، مركز عائلة ديفيد وفيلا شيبيل لأبحاث الاضطرابات الوراثية، معهد كيكست العائلي لعلم الوراثة الطبية، صندوق أبحاث الخلايا الجذعية للدكتور بيث روم-رايمر، مؤسسات إدموند دي روتشيلد، مؤسسة زانتكر الخيرية، مزرعة زفيا زيروني.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
