Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata
Summary
Una piattaforma potenziata per la coltura di embrioni interi consente uno sviluppo continuo e robusto in ex utero di embrioni di topo post-impianto per un massimo di sei giorni, dalle fasi di pre-costruzione fino all’organogenesi avanzata. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura standard per la coltura embrionale di successo utilizzando piastre statiche e sistemi di bottiglie rotanti.
Abstract
I metodi di coltura embrionale dei mammiferi post-impianto sono stati generalmente inefficienti e limitati a brevi periodi dopo la dissezione dall’utero. Recentemente sono state sviluppate piattaforme per colture ex utero altamente robuste e prolungate di embrioni di topo da stadi uovo-cilindro fino all’organogenesi avanzata. Queste piattaforme consentono uno sviluppo appropriato e fedele degli embrioni pregastrulanti (E5.5) fino allo stadio di formazione degli arti posteriori (E11). Gli embrioni a gastrulazione tardiva (E7.5) vengono coltivati in bottiglie rotanti in questi ambienti, mentre la coltura estesa dalle fasi di pre-costruzione (E5.5 o E6.5) richiede una combinazione di colture di bottiglie statiche e rotanti. Inoltre, la regolazione sensibile della concentrazione di O2 e CO2 , la pressione del gas, i livelli di glucosio e l’uso di uno specifico terreno di coltura ex utero sono fondamentali per il corretto sviluppo dell’embrione. Qui viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la coltura estesa di embrioni di topo ex utero. La capacità di far crescere embrioni di topo normali ex utero dalla gastrulazione all’organogenesi rappresenta uno strumento prezioso per caratterizzare l’effetto di diverse perturbazioni sperimentali durante lo sviluppo embrionale.
Introduction
Lo sviluppo intrauterino dell’embrione di mammifero ha limitato lo studio delle prime fasi dello sviluppo post-impianto1,2. L’inaccessibilità dell’embrione in via di sviluppo ostacola la comprensione dei principali processi di sviluppo che si verificano dopo l’impianto dell’embrione nell’utero, come la definizione del piano del corpo animale, la specifica degli strati germinali o la formazione di tessuti e organi. Inoltre, le dimensioni molto ridotte dell’embrione postimpinato precoce rendono difficile l’osservazione mediante imaging intravitale in utero prima di E103. L’incapacità di osservare e manipolare gli embrioni viventi in queste fasi ha limitato lo studio dell’embriogenesi post-impianto precoce a istantanee durante lo sviluppo.
I protocolli per la coltura in vitro di embrioni di mammiferi preimpianto sono ben consolidati, affidabili e utilizzati regolarmente4. Tuttavia, i tentativi di stabilire sistemi di coltura ex utero in grado di supportare una corretta crescita embrionale post-impianto di mammiferi hanno avuto un successo limitato5. Una varietà di tecniche di coltura sono state proposte per oltre un secolo, principalmente coltivando gli embrioni in piastre statiche convenzionali6,7,8 o bottiglie rotanti (colture a rulli)5,9,10. Queste piattaforme si sono rivelate utili per ampliare le conoscenze sullo sviluppo dei mammiferi dopo l’impianto11,12, nonostante siano altamente inefficienti per la normale sopravvivenza degli embrioni e limitate a brevi periodi. Gli embrioni hanno iniziato a mostrare ritardo dello sviluppo e anomalie morfologiche già 24-48 ore dopo l’inizio della coltura.
Questo studio fornisce una descrizione dettagliata per la creazione del sistema di coltura embrionale ex utero che consente uno sviluppo continuo dalla fase pre-costruzione alle fasi avanzate di organogenesi fino a sei giorni di sviluppo post-impianto13. Questo documento descrive il protocollo di coltura a rulli migliorato che supporta la crescita degli embrioni E7.5 (piastra neurale e stadio headfold) fino allo stadio di formazione degli arti posteriori (~ E11) e la coltura estesa da E5.5 / E6.5 combinando la coltura su piastre statiche e piattaforme di coltura a rulli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di coltura qui presentato può sostenere uno sviluppo corretto e continuo dell’embrione di topo ex utero per un massimo di sei giorni, da E5.5 a E11. In precedenza, gli embrioni in queste fasi di sviluppo potevano svilupparsi normalmente in coltura solo per brevi periodi (fino a 48 h)15. L’accoppiamento del modulo di regolazione del gas all’incubatore di coltura a rulli per un controllo preciso della concentrazione di ossigeno e della pressione iperbarica del gas è fondamen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da Pascal e Ilana Mantoux; Consiglio europeo della ricerca (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Consiglio di Ricerca Medica Assistente di Volo (FAMRI); Cattedra israelo cancer research Fund (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, the Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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