רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם
Summary
פלטפורמה משופרת לתרבות העוברים המלאים מאפשרת פיתוח רחם אקס רציף וחזק של עוברי עכבר לאחר ההשתלה עד שישה ימים, משלבי טרום ההדבקה ועד לאורגנוגנזה מתקדמת. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את ההליך הסטנדרטי לתרבות עוברית מוצלחת באמצעות לוחות סטטיים ומערכות בקבוק מסתובבות.
Abstract
שיטות התרבות של היונקים לאחר ההשתלה היו בדרך כלל לא יעילות ומוגבלות לתקופות קצרות לאחר ניתוח הרחם. פלטפורמות פותחו לאחרונה עבור תרבות רחם לשעבר חזקה וממושכת מאוד של עוברי עכבר משלבי גליל ביצה עד organogenesis מתקדם. פלטפורמות אלה מאפשרות פיתוח מתאים ונאמן של עוברים טרום-כבידה (E5.5) עד לשלב היווצרות הגפיים האחוריות (E11). עוברים גסטריים מאוחרים (E7.5) גדלים בבקבוקים מסתובבים בהגדרות אלה, בעוד שתרבות מורחבת משלבי טרום-סטרולציה (E5.5 או E6.5) דורשת שילוב של תרביות בקבוקים סטטיות ומסתובבות. בנוסף, רגולציה רגישה של ריכוז O2 ופחמן דו חמצני, לחץ גז, רמות גלוקוז, ושימוש במדיום תרבית הרחם לשעבר ספציפי הם קריטיים להתפתחות העובר הנכון. כאן, פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד עבור תרבות עובר עכבר הרחם לשעבר מורחב מסופק. היכולת לגדל עוברי עכבר רגילים לשעבר הרחם מן gastrulation כדי organogenesis מייצג כלי בעל ערך לאפיון ההשפעה של הפרעות ניסיוניות שונות במהלך התפתחות עוברית.
Introduction
ההתפתחות התוך רחמית של העובר היונקים הגבילה את המחקר של השלבים המוקדמים של התפתחות לאחר ההשתלה1,2. חוסר הנגישות של העובר המתפתח מעכב את ההבנה של תהליכים התפתחותיים מרכזיים המתרחשים לאחר השתלות העובר לרחם, כגון הקמת תוכנית גוף בעלי החיים, מפרט שכבות הנבט, או היווצרות רקמות ואיברים. יתר על כן, הגודל הקטן מאוד של העובר שלאחר ההשתלה המוקדמת מקשה על התבוננות על ידי הדמיה תוך-ויטמית ברחם לפני E103. חוסר היכולת להתבונן ולתפעל עוברים חיים בשלבים אלה הגבילה את המחקר של עוברי לאחר ההשתלה המוקדמים לתמונות במהלך ההתפתחות.
פרוטוקולים לתרבות הפריה חוץ גופית של עוברים יונקים טרום ההשתלה מבוססים היטב, אמינים, ומנוצלים באופן קבוע4. אף על פי כן, הניסיונות להקים מערכות תרבות הרחם לשעבר המסוגלות לתמוך בצמיחה נכונה של העובר לאחר ההשתלה היונקים נחלו הצלחה מוגבלת5. מגוון טכניקות תרבות הוצעו במשך למעלה ממאה שנה, בעיקר על ידי פולחן העוברים בלוחות סטטיים קונבנציונליים6,7,8 או בקבוקים מסתובבים (תרביות רולר)5,9,10. פלטפורמות אלה הוכיחו את עצמן כמועילות בהרחבת הידע על התפתחות היונקים לאחר ההשתלה 11,12, למרות היותן מאוד לא יעילות להישרדות העובר הרגילה ומוגבלות לתקופות קצרות. העוברים החלו להציג פיגור התפתחותי וחריגות מורפולוגיות כבר 24-48 שעות לאחר חניכת התרבות.
מחקר זה מספק תיאור מפורט להקמת מערכת תרבות העובר ברחם לשעבר המאפשרת התפתחות רציפה משלב טרום-אסטרולציה לשלבי אורגנוגנזה מתקדמים במשך עד שישה ימים של התפתחות לאחר ההשתלה13. מאמר זה מתאר את פרוטוקול תרבות הרולר המשופר התומך בצמיחה של עוברים E7.5 (לוח עצבי ושלב כיסוי הראש) עד שלב היווצרות הגפיים האחוריות (~ E11) ואת התרבות המורחבת מ- E5.5/ E6.5 על ידי שילוב תרבות על לוחות סטטיים ופלטפורמות תרבות רולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול התרבות המוצג כאן יכול לקיים רחם עובר עכבר תקין ומתמשך למשך עד שישה ימים, מ- E5.5 עד E11. בעבר, עוברים בשלבים התפתחותיים אלה יכולים להתפתח כרגיל בתרבות רק לתקופות קצרות (עד 48 שעות)15. הזיווג של מודול ויסות הגז לחממת תרבות הרולר לשליטה מדויקת בריכוז החמצן ולחץ הגז ההיפרב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי פסקל ואילנה מנטוקס; מועצת המחקר האירופית (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); דיילת המועצה למחקר רפואי (FAMRI); הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF), BSF, מכון הלן ומרטין קימל לחקר תאי גזע, פרס הלן ומרטין קימל לחקירה חדשנית; הקרן הישראלית למדע (ISF), מינרבה, מכון שרמן לכימיה רפואית, מרכז נלה וליאון בנוזיו למחלות נוירולוגיות, מרכז משפחת דוד ופלה שפל לחקר הפרעות גנטיות, מכון משפחת קססט לגנטיקה רפואית, קרן המחקר לתאי גזע של ד”ר בית רום-רמר, קרנות אדמונד דה רוטשילד, קרן הצדקה זנטקר, אחוזת צביה זרוני.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
