Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada
Summary
Uma plataforma aprimorada para a cultura de embriões integrais permite o desenvolvimento contínuo e robusto do ex útero de embriões de camundongos pós-implantação por até seis dias, desde estágios de pré-estresculação até organogênese avançada. Neste protocolo, detalhamos o procedimento padrão para a cultura de embriões bem sucedida usando placas estáticas e sistemas de garrafas rotativas.
Abstract
Métodos de cultura de embriões de mamíferos pós-postistas têm sido geralmente ineficientes e limitados a breves períodos após a dissecção fora do útero. Plataformas foram recentemente desenvolvidas para uma cultura ex utero altamente robusta e prolongada de embriões de camundongos desde estágios de cilindro de ovo até organogênese avançada. Essas plataformas permitem o desenvolvimento adequado e fiel de embriões pré-struladores (E5.5) até o estágio de formação de membros traseiros (E11). Embriões gastrulating tardios (E7.5) são cultivados em garrafas rotativas nessas configurações, enquanto a cultura estendida dos estágios de pré-estresculação (E5.5 ou E6.5) requer uma combinação de culturas estáticas e rotativas de garrafas. Além disso, regulação sensível da concentração de O2 e CO2 , pressão do gás, níveis de glicose e o uso de um meio específico de cultura ex utero são fundamentais para o desenvolvimento adequado de embriões. Aqui, é fornecido um protocolo passo-a-passo detalhado para a cultura estendida do embrião de camundongos ex-útero . A capacidade de cultivar embriões normais de camundongos ex utero de gastrulação à organogênese representa uma ferramenta valiosa para caracterizar o efeito de diferentes perturbações experimentais durante o desenvolvimento embrionário.
Introduction
O desenvolvimento intrauterino do embrião mamífero limitou o estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento pós-implantação1,2. A inacessibilidade do embrião em desenvolvimento dificulta a compreensão dos principais processos de desenvolvimento que ocorrem após os implantes de embriões no útero, como o estabelecimento do plano corporal animal, especificação das camadas germinativas ou a formação de tecidos e órgãos. Além disso, o tamanho muito pequeno do embrião postimplantado precoce dificulta a observação por imagem intravital no útero antes do E103. A incapacidade de observar e manipular embriões vivos nessas fases restringiu o estudo da embriogênese pós-implantação precoce a instantâneos durante o desenvolvimento.
Protocolos para cultura in vitro de embriões mamíferos pré-implantação são bem estabelecidos, confiáveis e regularmente utilizados4. No entanto, as tentativas de estabelecer sistemas de cultura ex-uteria capazes de suportar o crescimento adequado do embrião de postulação de mamíferos tiveram sucesso limitado5. Uma variedade de técnicas culturais têm sido propostas por mais de um século, principalmente por cultivar os embriões em placas estáticas convencionais6,7,8 ou garrafas rotativas (culturas de rolo)5,9,10. Essas plataformas se mostraram úteis na expansão do conhecimento sobre o desenvolvimento de mamíferos após a implantação11,12, apesar de serem altamente ineficientes para a sobrevivência normal de embriões e limitadas a períodos curtos. Os embriões começaram a apresentar retardamento do desenvolvimento e anomalias morfológicas logo 24-48 h após a iniciação cultural.
Este estudo fornece uma descrição detalhada para a criação do sistema de cultura de embriões ex utero que permite o desenvolvimento contínuo da pregastrulação aos estágios avançados de organogênese ao longo de até seis dias de desenvolvimento pós-implantação13. Este artigo descreve o protocolo de cultura de rolo aprimorado que suporta o crescimento de embriões E7.5 (placa neural e estágio de dobra de cabeça) até o estágio de formação de membros traseiros (~E11) e a cultura estendida de E5.5/E6.5, combinando cultura em placas estáticas e plataformas de cultura de rolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo cultural aqui apresentado pode sustentar o desenvolvimento adequado e contínuo do embrião do camundongo ex utero por até seis dias, de E5.5 a E11. Anteriormente, os embriões nessas etapas de desenvolvimento podiam desenvolver-se normalmente na cultura apenas por curtos períodos (até 48 h)15. O acoplamento do módulo de regulação do gás à incubadora de cultura de rolo para controle preciso da concentração de oxigênio e pressão do gás hiperbárico é fundamental p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por Pascal e Ilana Mantoux; Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Conselho de Pesquisa Médica da Comissária de Bordo (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen e Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, o Instituto Sherman de Química Medicinal, Nella e Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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