Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada
Summary
Una plataforma mejorada para el cultivo de embriones enteros permite el desarrollo continuo y robusto ex utero de embriones de ratón postimplantación durante un máximo de seis días, desde las etapas de pregastrulación hasta la organogénesis avanzada. En este protocolo, detallamos el procedimiento estándar para el cultivo exitoso de embriones utilizando placas estáticas y sistemas de botellas giratorias.
Abstract
Los métodos de cultivo de embriones de mamíferos postimplantación han sido generalmente ineficientes y limitados a breves períodos después de la disección fuera del útero. Recientemente se han desarrollado plataformas para el cultivo ex utero altamente robusto y prolongado de embriones de ratón desde las etapas de cilindro de huevo hasta la organogénesis avanzada. Estas plataformas permiten un desarrollo adecuado y fiel de embriones pregastrulantes (E5.5) hasta la etapa de formación del miembro posterior (E11). Los embriones de gastrulación tardía (E7.5) se cultivan en botellas giratorias en estos entornos, mientras que el cultivo extendido de las etapas de pregastrulación (E5.5 o E6.5) requiere una combinación de cultivos de botellas estáticas y giratorias. Además, la regulación sensible de la concentración de O2 y CO2 , la presión del gas, los niveles de glucosa y el uso de un medio de cultivo ex utero específico son críticos para el desarrollo adecuado del embrión. Aquí, se proporciona un protocolo detallado paso a paso para el cultivo extendido de embriones de ratón ex útero. La capacidad de cultivar embriones de ratón normales ex utero desde la gastrulación hasta la organogénesis representa una herramienta valiosa para caracterizar el efecto de diferentes perturbaciones experimentales durante el desarrollo embrionario.
Introduction
El desarrollo intrauterino del embrión de mamífero ha limitado el estudio de las primeras etapas del desarrollo postimplantacional1,2. La inaccesibilidad del embrión en desarrollo dificulta la comprensión de los procesos clave de desarrollo que ocurren después de que el embrión se implanta en el útero, como el establecimiento del plan corporal animal, la especificación de las capas germinales o la formación de tejidos y órganos. Además, el tamaño muy pequeño del embrión postimplantado temprano dificulta la observación por imágenes intravitales en el útero antes de E103. La incapacidad de observar y manipular embriones vivos en estas etapas ha restringido el estudio de la embriogénesis postimplantacional temprana a instantáneas durante el desarrollo.
Los protocolos para el cultivo in vitro de embriones de mamíferos preimplantacionales están bien establecidos, son confiables y se utilizan regularmente4. Sin embargo, los intentos de establecer sistemas de cultivo ex utero capaces de soportar el crecimiento adecuado de embriones postimplantacionales de mamíferos tuvieron un éxito limitado5. Desde hace más de un siglo se han propuesto diversas técnicas de cultivo, principalmente mediante el cultivo de los embriones en placas estáticas convencionales6,7,8 o botellas giratorias (cultivos con rodillos)5,9,10. Estas plataformas demostraron ser útiles para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de los mamíferos después de la implantación11,12, a pesar de ser altamente ineficientes para la supervivencia embrionaria normal y limitadas a períodos cortos. Los embriones comenzaron a mostrar retraso en el desarrollo y anomalías morfológicas tan pronto como 24-48 h después del inicio del cultivo.
Este estudio proporciona una descripción detallada para configurar el sistema de cultivo embrionario ex utero que permite el desarrollo continuo desde la pregastrulación hasta las etapas avanzadas de organogénesis durante hasta seis días de desarrollo postimplantacional13. Este artículo describe el protocolo mejorado de cultivo de rodillos que apoya el crecimiento de embriones E7.5 (placa neural y etapa de pliegue de la cabeza) hasta la etapa de formación de la extremidad posterior (~ E11) y el cultivo extendido de E5.5 / E6.5 mediante la combinación de cultivo en placas estáticas y plataformas de cultivo de rodillos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de cultivo presentado aquí puede mantener un desarrollo embrionario de ratón adecuado y continuo ex utero durante un máximo de seis días, desde E5.5 hasta E11. Anteriormente, los embriones en estas etapas de desarrollo podían desarrollarse normalmente en cultivo solo por períodos cortos (hasta 48 h)15. El acoplamiento del módulo de regulación de gas a la incubadora de cultivo de rodillos para un control preciso de la concentración de oxígeno y la presión de gas hip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por Pascal e Ilana Mantoux; Consejo Europeo de Investigación (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Consejo de Investigación Médica de Auxiliares de Vuelo (FAMRI); Cátedra del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (ICRF), BSF, Instituto Helen y Martin Kimmel para la Investigación de Células Madre, Premio Helen y Martin Kimmel a la Investigación Innovadora; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, el Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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