İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü
Summary
Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur. Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.
Abstract
Mitokondri, enerji arzını ve hücrenin genel sağlığını belirleyen önemli metabolik ve düzenleyici organellerdir. İskelet kasında mitokondri, küçük oval organellerden geniş, retikülum benzeri bir ağa kadar bir dizi karmaşık morfolojide bulunur. Mitokondriyal retikülün enerji talebindeki değişiklikler gibi çeşitli uyaranlara yanıt olarak nasıl genişlediğini ve geliştiğini anlamak uzun zamandır bir araştırma konusudur. Bu büyümenin veya biyogenezin önemli bir yönü, başlangıçta nükleer genom tarafından kodlanan, sitozolde sentezlenen ve çeşitli mitokondriyal alt bölmelere dönüştürülen öncül proteinlerin ithalatıdır. Mitokondri, protein ithalat makineleri (PIM) olarak bilinen birçok seçici iç ve dış zar kanalını içeren bu ithalat süreci için sofistike bir mekanizma geliştirmiştir. Mitokondryona ithalat, uygulanabilir membran potansiyeline ve oksidatif fosforilasyon yoluyla organel türevi ATP’nin mevcudiyetine bağlıdır. Bu nedenle ölçümü organel sağlığının bir ölçüsü olarak hizmet edebilir. PIM ayrıca iskelet kasında hücrenin enerji durumuna sıkıca bağlı yüksek düzeyde adaptif plastisite sergiler. Örneğin, egzersiz eğitiminin ithalat kapasitesini artırdığı, kas disuse’un ise mitokondriyal içerik belirteçlerindeki değişikliklerle çakıştığı gösterilmiştir. Protein ithalatı mitokondrilerin biyogenezinde ve genişlemesinde kritik bir adım olmasına rağmen, iskelet kasında süreç yaygın olarak incelenmemektedir. Bu nedenle, bu makale, ilgili yöntemlerin daha iyi anlaşılmasını ve egzersiz, sağlık ve hastalıkta organel ciro için yolun öneminin takdirini teşvik etmek için protein ithalat kapasitesini ölçmek için iskelet kasından izole edilmiş ve tamamen işlevsel mitokondrilerin nasıl kullanılacağını özetlemektedir.
Introduction
Mitokondriler, farklı hücre tiplerindeki karmaşık morfolojilerde bulunan ve hücresel sağlık için kritik olan artan bir işlev dizisine sahip olduğu kabul edilen organellerdir. Bu nedenle, artık sadece enerji üreten organellere indirgenemezler. Mitokondriler, temel metabolik düzenleyiciler, hücre kaderinin belirleyicileri ve işlevleri genel hücresel sağlığın yararlı göstergeleri olarak hizmet edebilecek sinyal merkezleridir. İskelet kas hücrelerinde elektron mikroskopi çalışmaları, şu anda iskelet kası aktivite düzeylerindeki değişikliklerin yanı sıra yaş ve hastalıkla birlikte son derece dinamik ve uyarlanabilir olduğu kabul edilen bir bağlantı derecesi sergileyen coğrafi olarak farklı subsarkolemal (SS) ve intermyofibriller (IMF) mitokondrilerin varlığını ortaya koymaktadır. Kastaki mitokondriyal içerik ve fonksiyon çok sayıda şekilde değerlendirilebilir5,6 ve hücresel milieu7,8’in etkisinden farklı mitokondrilerin solunum ve enzimatik kapasitelerini (Vmax) daha iyi anlamak için geleneksel organel izolasyon yöntemleri uygulanmıştır. Özellikle, bu geleneksel yöntemler, subsarkolemal ve intermiyofibriller bölgelerden izole edilen mitokondriler arasındaki ince biyokimyasal ayrımları ortaya çıkarmış ve bu hücre altı bölgelerde metabolizma için olası fonksiyonel etkileri ortaya çıkarmıştır8,9,10,11.
Mitokondri biyogenez, hem nükleer hem de mitokondriyal DNA’dan gen ürünlerinin katkısını gerektirmede benzersizdir. Bununla birlikte, bunların büyük çoğunluğu çekirdekten türetilmiştir, çünkü mtDNA transkripsiyonu sadece 13 proteinin sentezine yol açar. Mitokondri normalde çeşitli metabolik yollarda yer alan >1000 proteinden oluştuğundan, organel biyogenez, uygun stoichiometry ve fonksiyonu korumak için sitozolden çeşitli mitokondriyal alt bölmelere öncül proteinlerin sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir ithalat ve montaj aracı gerektirir12,13. Mitokondrilere yönelik nükleer kodlanmış proteinler normalde onları organellere hedefleyen ve alt bölümler arası lokalizasyonlarını kolaylaştıran bir mitokondriyal hedefleme dizisi (MTS) taşırlar. Matrise bağlı proteinlerin çoğu bölünebilir bir N-terminal MTS içerirken, dış veya iç mitokondriyal membran için uygun olanlar genellikle iç hedefleme alanlarına sahiptir14. İthalat işlemi, organel13’e giriş için birden fazla yol sağlayan bir dizi farklı kanal tarafından gerçekleştirilir. Dış membran (TOM) kompleksinin translokazı, sitozolden iç zar (Tİm) kompleksinin translokazı tarafından tanındıkları intermembran uzayına öncüller. Bu kompleks, proteazların N-terminali hedefleme ön sırasını ayırdığı matrise nükleer kodlanmış öncüllerin içe aktarıcılarından sorumludur. Dış zara yönelik proteinler tom kompleksi aracılığıyla doğrudan bu zara yerleştirilebilirken, iç zara yönelik olanlar bir TIM proteini, özellikle TIM22 tarafından yerleştirilir. İthalatlarından sonra, proteinler yerleşik proteazlar ve refakatçiler tarafından daha fazla işlenir ve genellikle elektron taşıma zincirinde bulunanlar gibi daha büyük kompleksler oluşturmak için birleştirilir.
Mitokondriyal protein ithalatının kendisi de mitokondriyal sağlığın bir ölçümü olarak hizmet eder, çünkü bu işlem membran potansiyelinin varlığına ve ATP15 şeklinde bir enerji kaynağına dayanır. Örneğin, membran potansiyeli dağıldığında, protein kinaz PINK1 organel tarafından alınamaz ve bu, mitophagy16,17 adı verilen bir yoldan organeldeki bozulmanın başlangıcını tetikleyen fosforilasyon sinyallerine yol açar. Benzer durumlarda, ithalat engellendiğinde, ATF5 proteini organel içine giremez ve daha sonra UPR gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu için bir transkripsiyon faktörü olarak hizmet ettiği çekirdeğe yer değişir18,19. Bu nedenle, protein ithalat verimliliğini ölçmek organel sağlığı hakkında kapsamlı bir içgörü sağlarken, gen ekspresyon yanıtı çekirdeğe retrograd sinyal verme derecesini belirtmek için kullanılabilir.
Mitokondri biyogenezinin ve genel olarak hücresel sağlığın bariz önemine rağmen, memeli mitokondrilerinde ithalat yolu dikkat çekici bir şekilde yetersizdir. Bu raporda, öncül proteinlerin iskelet kası mitokondrilerine ithalatının ölçülmesinde yer alan belirli adımları açıklar ve ithalat sisteminin kas ve disuse değişikliklere adaptif tepkisini göstermek için veriler sağlayarak, protein ithalatının iskelet kasının adaptif plastisitesine katkısını gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriler, hücreler içindeki sentezleri ve genişlemeleri için hem nükleer hem de mitokondriyal genomların ifade ve koordinasyonuna benzersiz bir şekilde bağlıdır. Bununla birlikte, nükleer genom mitokondriyal proteomun büyük çoğunluğunu (%99) kodlar ve bu, protein ithalat makinelerinin mitokondriyal biyogenezin desteklenmesindeki öneminin altını çizmektedir. İthalat aynı zamanda önemli bir sinyal olayı olarak hizmet eder, çünkü ithalat başarısızlığı, katlanmış protein yanıtının v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, mcgill üniversitesinden Dr. G.C. Shore’a, Washington Tıp Fakültesi’nden Dr. A. Strauss’a ve La Trobe Üniversitesi’nden Dr.M.T. Ryan’a bu araştırma için kullanılan ifade plazmidlerinin orijinal bağışları için teşekkür eder. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi’nden (NSERC) D. A. Hood’a fon sağlanmasıyla desteklendi. D. A. Hood aynı zamanda Hücre Fizyolojisi’nde Kanada Araştırma Başkanı’nın sahibidir.
Materials
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
| Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | Sigma | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
| Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
| Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
| Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
| Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
| MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
| pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
| pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
| Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
| RNAsin | Promega | N2311 | |
| Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
| Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
| Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
| Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
| Sorbitol | Sigma | S6021 | |
| SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
| Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |
References
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
- Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
- Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
- Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
- Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
- Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
- Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
- Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
- Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
- Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
- Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
- Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria – A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
- Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
- Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
- Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
- Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
- Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
- Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
- Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
- Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
- Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
- Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
- Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
- Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
- Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
- Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
- Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
- Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
- Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
- Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).
