Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Mitochondriën zijn organellen die bestaan in complexe morfologieën in verschillende celtypen en waarvan wordt erkend dat ze een toenemend scala aan functies bezitten die van cruciaal belang zijn voor de cellulaire gezondheid. Als zodanig kunnen ze niet langer alleen worden gereduceerd tot energieproducerende organellen. Mitochondriën zijn belangrijke metabole regulatoren, determinanten van het lot van cellen en signaleringshubs, waarvan de functies kunnen dienen als nuttige indicatoren voor de algehele cellulaire gezondheid. In skeletspiercellen onthullen elektronenmicroscopiestudies de aanwezigheid van geografisch verschillende subsarcolemmale (SS) en intermyofibrillaire (IMF) mitochondriën, die een mate van connectiviteit vertonen1,2,3,4 waarvan nu wordt erkend dat ze zeer dynamisch zijn en zich kunnen aanpassen aan veranderingen in skeletspieractiviteitsniveaus, evenals met leeftijd en ziekte. Mitochondriale inhoud en functie in spieren kunnen op verschillende manieren worden ^{beoordeeld5,6}, en traditionele methoden van organelisolatie zijn toegepast om de ademhalings- en enzymatische capaciteiten (Vmax) van mitochondriën beter te begrijpen die verschillen van de invloed van het cellulaire ^milieu7,8. In het bijzonder hebben deze traditionele methoden subtiele biochemische verschillen onthuld tussen mitochondriën geïsoleerd uit subsarcolemmale en intermyofibrillaire regio’s, wat mogelijke functionele implicaties voor het metabolisme in deze subcellulaire regio’s ligt8,9,10,11.

De biogenese van mitochondriën is uniek in het vereisen van de bijdrage van genproducten uit zowel nucleair als mitochondriaal DNA. De overgrote meerderheid hiervan is echter afgeleid van de kern, omdat mtDNA-transcriptie alleen leidt tot de synthese van 13 eiwitten. Aangezien mitochondriën normaal gesproken >1000 eiwitten bevatten die betrokken zijn bij diverse metabole routes, vereist biogenese van het organel een strak gereguleerd middel voor import en assemblage van precursoreiwitten uit het cytosol in de verschillende mitochondriale subcompartimenten om de juiste stoichiometrie en functie te ^{behouden12,13}. Nucleair gecodeerde eiwitten bestemd voor mitochondriën dragen normaal gesproken een mitochondriale targetingsequentie (MTS) die hen op het organel richt en hun subcompartimentale lokalisatie vergemakkelijkt. De meeste matrixgebonden eiwitten bevatten een splijtbare N-terminale MTS, terwijl die bestemd voor het buitenste of binnenste mitochondriale membraan meestal interne targetingdomeinen ^hebben14. Het importproces wordt uitgevoerd door een reeks verschillende kanalen die meerdere mogelijkheden bieden voor toegang tot het ^organel13. De translocase van het buitenmembraan (TOM) complex pendelt voorlopers van het cytosol naar de intermembraanruimte, waar ze worden herkend door de translocase van het binnenmembraan (TIM) complex. Dit complex is verantwoordelijk voor het importeren van nucleair gecodeerde precursoren in de matrix, waar proteasen de N-terminal splitsen en zich richten op presequence. Eiwitten bestemd voor het buitenmembraan kunnen rechtstreeks in dit membraan worden ingebracht via het TOM-complex, terwijl die bestemd voor het binnenmembraan worden ingebracht door een TIM-eiwit, met name TIM22. Na hun import worden eiwitten verder verwerkt door residente proteasen en chaperones en combineren ze vaak om grotere complexen te vormen, zoals die in de elektronentransportketen.

Mitochondriale eiwitimport zelf dient ook als een meting van mitochondriale gezondheid, omdat dit proces afhankelijk is van de aanwezigheid van membraanpotentiaal en een bron van energie in de vorm van ^ATP15. Wanneer bijvoorbeeld de membraanpotentiaal wordt gedissipeerd, kan eiwitkinase PINK1 niet door het organel worden opgenomen, en dit leidt tot fosforyleringssignalen die het begin van de afbraak van het organel veroorzaken via een route die mitofagie wordt ^genoemd16,17. Onder vergelijkbare omstandigheden, wanneer de import wordt belemmerd, kan het eiwit ATF5 het organel niet binnendringen en transloceert het vervolgens naar de kern, waar het dient als transcriptiefactor voor de up-regulatie van UPR-genexpressie18,19. Zo kan het meten van eiwitimportefficiëntie uitgebreid inzicht geven in de gezondheid van het organel, terwijl de genexpressierespons kan worden gebruikt om de mate van retrograde signalering naar de kern aan te geven.

Ondanks het duidelijke belang ervan voor de biogenese van mitochondriën en voor de cellulaire gezondheid in het algemeen, is de importroute in mitochondriën van zoogdieren opmerkelijk onderbelicht. In dit rapport beschrijven we de specifieke stappen die betrokken zijn bij het meten van de import van precursoreiwitten in mitochondriën van de skeletspieren en leveren we gegevens om de adaptieve reactie van het importsysteem op veranderingen in spieren en onbruik te illustreren, wat de bijdrage van de eiwitimport aan de adaptieve plasticiteit van skeletspieren illustreert.