Summary

Измерение способности митохондрий скелетных мышц импортировать белок

Published: January 07, 2022
doi:

Summary

Митохондрии являются ключевыми метаболическими органеллами, которые демонстрируют высокий уровень фенотипической пластичности в скелетных мышцах. Импорт белков из цитозоля является критическим путем для биогенеза органелл, необходимым для расширения ретикулума и поддержания функции митохондрий. Поэтому импорт белка служит барометром клеточного здоровья.

Abstract

Митохондрии являются ключевыми метаболическими и регуляторными органеллами, которые определяют энергоснабжение, а также общее состояние здоровья клетки. В скелетных мышцах митохондрии существуют в серии сложных морфологий, начиная от небольших овальных органелл до широкой, похожей на ретикулум сети. Понимание того, как митохондриальный ретикулум расширяется и развивается в ответ на различные стимулы, такие как изменения в спросе на энергию, уже давно является темой исследований. Ключевым аспектом этого роста, или биогенеза, является импорт белков-предшественников, первоначально кодируемых ядерным геномом, синтезированных в цитозоле и транслоцированных в различные митохондриальные субкомпоненты. Митохондрии разработали сложный механизм для этого процесса импорта, включающий множество селективных внутренних и внешних мембранных каналов, известных как механизм импорта белка (PIM). Импорт в митохондрии зависит от жизнеспособного мембранного потенциала и наличия АТФ, полученного из органелл, путем окислительного фосфорилирования. Поэтому его измерение может служить мерой здоровья органелл. PIM также демонстрирует высокий уровень адаптивной пластичности в скелетных мышцах, которая тесно связана с энергетическим статусом клетки. Например, было показано, что физические упражнения увеличивают импортную способность, в то время как мышечное неиспользование уменьшает ее, совпадая с изменениями маркеров содержания митохондрий. Хотя импорт белка является критическим шагом в биогенезе и расширении митохондрий, этот процесс не широко изучен в скелетных мышцах. Таким образом, в этой статье описывается, как использовать изолированные и полностью функциональные митохондрии из скелетных мышц для измерения способности импортировать белок, чтобы способствовать лучшему пониманию используемых методов и оценке важности пути для оборота органелл в физических упражнениях, здоровье и болезнях.

Introduction

Митохондрии — это органеллы, которые существуют в сложных морфологиях в различных типах клеток и, как признано, обладают растущим набором функций, которые имеют решающее значение для здоровья клеток. Как таковые, они больше не могут быть сведены только к органеллам, производящим энергию. Митохондрии являются ключевыми метаболическими регуляторами, детерминантами судьбы клеток и сигнальными центрами, функции которых могут служить полезными индикаторами общего клеточного здоровья. В клетках скелетных мышц исследования электронной микроскопии показывают наличие географически различных субсарколеммальных (SS) и межмиофибриллярных (IMF) митохондрий, которые демонстрируют степень связности1,2,3,4, которая в настоящее время признана очень динамичной и адаптируемой к изменениям в уровнях активности скелетных мышц, а также с возрастом и болезнями. Содержание и функция митохондрий в мышцах могут быть оценены различными способами5,6, и традиционные методы выделения органелл были применены для лучшего понимания дыхательных и ферментативных возможностей (Vmax) митохондрий, отличных от влияния клеточной среды7,8. В частности, эти традиционные методы выявили тонкие биохимические различия между митохондриями, выделенными из субсарколеммальных и межмиофибриллярных областей, опровергая возможные функциональные последствия для метаболизма в этих субклеточных областях8,9,10,11.

Биогенез митохондрий уникален тем, что требует вклада генных продуктов как из ядерной, так и из митохондриальной ДНК. Однако подавляющее большинство из них получено из ядра, поскольку транскрипция мтДНК приводит только к синтезу 13 белков. Поскольку митохондрии обычно содержат >1000 белков, участвующих в различных метаболических путях, биогенез органеллы требует жестко регулируемых средств импорта и сборки белков-предшественников из цитозола в различные митохондриальные подкомпоненты для поддержания надлежащей стехиометрии и функции12,13. Ядерно-кодированные белки, предназначенные для митохондрий, обычно несут митохондриальную целевую последовательность (MTS), которая нацеливает их на органеллу и облегчает их субкомпарментальную локализацию. Большинство связанных с матрицей белков содержат расщепляемый N-концевой MTS, в то время как те, которые предназначены для внешней или внутренней митохондриальной мембраны, обычно имеют внутренние целевые домены14. Процесс импорта осуществляется по набору разнообразных каналов, которые обеспечивают несколько путей для входа в органеллу13. Транслоказ комплекса наружной мембраны (TOM) переносит предшественников из цитозола в межмембранное пространство, где они распознаются транслоказой комплекса внутренней мембраны (TIM). Этот комплекс отвечает за импорт ядерно-кодированных прекурсоров в матрицу, где протеазы расщепляют N-концевую целевую пресеквацию. Белки, предназначенные для внешней мембраны, могут быть непосредственно вставлены в эту мембрану через комплекс TOM, в то время как те, которые предназначены для внутренней мембраны, вставляются белком TIM, в частности TIM22. После их импорта белки дополнительно обрабатываются резидентными протеазами и шаперонами и часто объединяются, образуя более крупные комплексы, такие как те, которые обнаружены в цепи переноса электронов.

Сам импорт митохондриального белка также служит измерением здоровья митохондрий, так как этот процесс опирается на наличие мембранного потенциала и источника энергии в виде АТФ15. Например, когда мембранный потенциал рассеивается, протеинкиназа PINK1 не может быть поглощена органеллой, и это приводит к сигналам фосфорилирования, которые вызывают начало деградации органеллы через путь, называемый митофагией16,17. При аналогичных обстоятельствах, когда импорт затруднен, белок ATF5 не может попасть в органеллу, и впоследствии он перемещается в ядро, где он служит фактором транскрипции для повышения регуляции экспрессии гена УПО18,19. Таким образом, измерение эффективности импорта белка может обеспечить всестороннее понимание здоровья органеллы, в то время как реакция экспрессии генов может быть использована для указания степени ретроградной передачи сигналов в ядро.

Несмотря на его очевидную важность для биогенеза митохондрий и для клеточного здоровья в целом, путь импорта в митохондриях млекопитающих удивительно недостаточно изучен. В этом отчете мы описываем конкретные шаги, связанные с измерением импорта белков-предшественников в митохондрии скелетных мышц, и предоставляем данные, иллюстрирующие адаптивную реакцию системы импорта на изменения в мышцах и неиспользование, иллюстрируя вклад импорта белка в адаптивную пластичность скелетных мышц.

Protocol

Все животные, используемые в этих экспериментах, содержатся в учреждении по уходу за животными в Йоркском университете. Эксперименты проводятся в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными с одобрения Комитета по уходу за животными Йоркского униве…

Representative Results

Мы подробно проиллюстрировали, что этот протокол является действительным анализом для определения скорости импорта в функциональные и интактные изолированные митохондрии скелетных мышц. По сравнению с необработанными условиями, импорт типичных белков-предшественников, таких как ма…

Discussion

Митохондрии уникально зависят от экспрессии и координации как ядерного, так и митохондриального геномов для их синтеза и расширения в клетках. Тем не менее, ядерный геном кодирует подавляющее большинство (99%) митохондриального протеома, и это подчеркивает важность механизма импорта бе…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Г.C Шора из Университета Макгилла, доктора А. Штрауса из Вашингтонской школы медицины и доктора .M.Т. Райана из Университета Ла Троуб за оригинальные пожертвования экспрессионных плазмид, которые были использованы для этого исследования. Эта работа была поддержана финансированием со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) Д. А. Худа. Д. А. Худ также является обладателем Канадской исследовательской кафедры в области клеточной физиологии.

Materials

0.2% BSA Sigma A2153
35S-methionine Perkin Elmer NEG709A500UC Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP Sigma A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper Thermo Fisher 05-714-5
Cassette for film Kodak Kodak Xomatic
Centrifugation Tube Thermo Fisher 3138-0050
Chloroform Thermo Fisher C298-4
DTT Sigma D9779-5G
EDTA BioShop EDT002
EGTA Sigma E4378
Gel Dryer BioRad Model 583
Gel Drying Kit Sigma or BioRad Z377570-1PAK or OW-GDF-10 Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol Caledon Laboratory Chemicals 5350-1-40
HEPES Sigma H3375
High Speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer IKA T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol Sigma I9392
KAc BioShop POA301.500
KCl Sigma P3911
M7G New England Biolab S1404S Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl BioShop MAG510
MgSO4 Thermo Fisher M65-500
MOPS BioShop MOP001
NaCl BioShop SOD001
NTP Thermo Fisher R0191
OCT Plasmid Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol Sigma P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol Sigma P3803 Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film Fujifilm BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate Promega L4960 Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin Promega N2311
Rotor for High Speed Centrifuge Beckman Coulter JA-25.50
SDS BioShop SDS001.500 Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate Bioshop SAA 304
Sodium Carbonate VWR BDH9284
Sodium salicylate Millipore Sigma 106601
Sorbitol Sigma S6021
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
Spectrophotometer Thermo Fisher Nanodrop 2000
Spermidine Sigma S-2626
Sucrose BioShop SUC507
T7 RNA Polymerase Promega P2075
Tabletop Centrifuge Thermo Fisher AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid Thermo Fisher A322-500
Tris BioShop TRS001
β-mercaptoethanol Sigma M6250-100ML

References

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria – A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Play Video

Cite This Article
Oliveira, A. N., Richards, B. J., Hood, D. A. Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria. J. Vis. Exp. (179), e63055, doi:10.3791/63055 (2022).

View Video