Summary

Mesure de la capacité d’importation de protéines des mitochondries du muscle squelettique

Published: January 07, 2022
doi:

Summary

Les mitochondries sont des organites métaboliques clés qui présentent un niveau élevé de plasticité phénotypique dans le muscle squelettique. L’importation de protéines du cytosol est une voie critique pour la biogenèse des organites, essentielle à l’expansion du réticulum et au maintien de la fonction mitochondriale. Par conséquent, l’importation de protéines sert de baromètre de la santé cellulaire.

Abstract

Les mitochondries sont des organites métaboliques et régulateurs clés qui déterminent l’approvisionnement en énergie ainsi que la santé globale de la cellule. Dans le muscle squelettique, les mitochondries existent dans une série de morphologies complexes, allant de petits organites ovales à un large réseau en forme de réticulum. Comprendre comment le réticulum mitochondrial se dilate et se développe en réponse à divers stimuli tels que les altérations de la demande d’énergie est depuis longtemps un sujet de recherche. Un aspect clé de cette croissance, ou biogenèse, est l’importation de protéines précurseurs, codées à l’origine par le génome nucléaire, synthétisées dans le cytosol et translocalisées dans divers sous-compartiments mitochondriaux. Les mitochondries ont développé un mécanisme sophistiqué pour ce processus d’importation, impliquant de nombreux canaux membranaires internes et externes sélectifs, connus sous le nom de machinerie d’importation de protéines (PIM). L’importation dans la mitochondrie dépend du potentiel membranaire viable et de la disponibilité de l’ATP dérivé des organites par phosphorylation oxydative. Par conséquent, sa mesure peut servir de mesure de la santé des organites. Le PIM présente également un haut niveau de plasticité adaptative dans le muscle squelettique qui est étroitement couplé à l’état énergétique de la cellule. Par exemple, il a été démontré que l’entraînement physique augmente la capacité d’importation, tandis que la désutilisation musculaire la réduit, coïncidant avec des changements dans les marqueurs du contenu mitochondrial. Bien que l’importation de protéines soit une étape critique dans la biogenèse et l’expansion des mitochondries, le processus n’est pas largement étudié dans le muscle squelettique. Ainsi, cet article explique comment utiliser des mitochondries isolées et entièrement fonctionnelles du muscle squelettique pour mesurer la capacité d’importation de protéines afin de promouvoir une meilleure compréhension des méthodes impliquées et une appréciation de l’importance de la voie du renouvellement des organites dans l’exercice, la santé et la maladie.

Introduction

Les mitochondries sont des organites qui existent dans des morphologies complexes dans différents types de cellules et sont reconnus pour posséder un éventail croissant de fonctions essentielles à la santé cellulaire. En tant que tels, ils ne peuvent plus être réduits à de simples organites producteurs d’énergie. Les mitochondries sont des régulateurs métaboliques clés, des déterminants du devenir cellulaire et des centres de signalisation, dont les fonctions peuvent servir d’indicateurs utiles de la santé cellulaire globale. Dans les cellules musculaires squelettiques, les études de microscopie électronique révèlent la présence de mitochondries sous-sarmateuses (SS) et intermyofibrillaires (IMF) géographiquement distinctes, qui présentent un degré de connectivité1,2,3,4 qui est maintenant reconnu comme étant très dynamique et adaptable aux changements dans les niveaux d’activité musculaire squelettique, ainsi qu’avec l’âge et la maladie. Le contenu et la fonction mitochondriaux dans les muscles peuvent être évalués de nombreuses façons5,6, et des méthodes traditionnelles d’isolement des organites ont été appliquées pour mieux comprendre les capacités respiratoires et enzymatiques (Vmax) des mitochondries distinctes de l’influence du milieu cellulaire7,8. En particulier, ces méthodes traditionnelles ont révélé des distinctions biochimiques subtiles entre les mitochondries isolées des régions sous-sarmateuses et intermyofibrillaires, démentant les implications fonctionnelles possibles pour le métabolisme dans ces régions subcellulaires8,9,10,11.

La biogenèse des mitochondries est unique en ce sens qu’elle nécessite la contribution de produits géniques de l’ADN nucléaire et mitochondrial. Cependant, la grande majorité d’entre eux sont dérivés du noyau puisque la transcription de l’ADNmt ne conduit qu’à la synthèse de 13 protéines. Étant donné que les mitochondries comprennent normalement >1000 protéines impliquées dans diverses voies métaboliques, la biogenèse de l’organite nécessite un moyen étroitement régulé d’importation et d’assemblage des protéines précurseurs du cytosol dans les différents sous-compartiments mitochondriaux pour maintenir une stœchiométrie et une fonction appropriées12,13. Les protéines codées par le nucléaire destinées aux mitochondries portent normalement une séquence de ciblage mitochondrial (MTS) qui les cible vers l’organite et facilite leur localisation sous-compartimentale. La plupart des protéines liées à la matrice contiennent un MTS N-terminal clivable, tandis que celles destinées à la membrane mitochondriale externe ou interne ont généralement des domaines de ciblage internes14. Le processus d’importation est effectué par un ensemble de canaux divers qui offrent de multiples voies d’entrée dans l’organite13. La translocase du complexe de membrane externe (TOM) transporte les précurseurs du cytosol dans l’espace intermembranaire, où ils sont reconnus par la translocase du complexe de membrane interne (TIM). Ce complexe est responsable de l’importation de précurseurs codés par le nucléaire dans la matrice, où les protéases clivent la préséquence de ciblage N-terminal. Les protéines destinées à la membrane externe peuvent être directement insérées dans cette membrane à travers le complexe TOM, tandis que celles destinées à la membrane interne sont insérées par une protéine TIM, en particulier TIM22. Après leur importation, les protéines sont ensuite traitées par les protéases et les chaperons résidents et se combinent souvent pour former des complexes plus grands, tels que ceux trouvés dans la chaîne de transport d’électrons.

L’importation de protéines mitochondriales elle-même sert également de mesure de la santé mitochondriale, car ce processus repose sur la présence d’un potentiel membranaire et d’une source d’énergie sous forme d’ATP15. Par exemple, lorsque le potentiel membranaire est dissipé, la protéine kinase PINK1 ne peut pas être absorbée par l’organite, ce qui conduit à des signaux de phosphorylation qui déclenchent l’apparition de la dégradation de l’organite par une voie appelée mitophagie16,17. Dans des circonstances similaires, lorsque l’importation est entravée, la protéine ATF5 ne peut pas pénétrer dans l’organite, et elle se transloque ensuite vers le noyau, où elle sert de facteur de transcription pour la régulation à la hausse de l’expression du gène UPR18,19. Ainsi, la mesure de l’efficacité de l’importation de protéines peut fournir un aperçu complet de la santé de l’organite, tandis que la réponse à l’expression génique peut être utilisée pour indiquer le degré de signalisation rétrograde au noyau.

Malgré son importance évidente pour la biogenèse des mitochondries et pour la santé cellulaire en général, la voie d’importation dans les mitochondries des mammifères est remarquablement sous-étudiée. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes spécifiques impliquées dans la mesure de l’importation de protéines précurseurs dans les mitochondries des muscles squelettiques et fournissons des données pour illustrer la réponse adaptative du système d’importation aux changements musculaires et à la désuétude, illustrant la contribution de l’importation de protéines à la plasticité adaptative du muscle squelettique.

Protocol

Tous les animaux utilisés dans ces expériences sont gardés dans l’établissement de soins aux animaux de l’Université York. Les expériences sont menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux avec l’approbation du Comité des soins aux animaux de l’Université York (permis : 2017-08). 1. Isolement fonctionnel des mitochondries sous-sarmateuses et intermyofibrillaires du muscle squelettique Préparation du réactif: Pré…

Representative Results

Nous avons largement illustré que ce protocole est un test valide pour déterminer le taux d’importation dans les mitochondries musculaires squelettiques isolées fonctionnelles et intactes. Par rapport aux affections non traitées, l’importation de protéines précurseurs typiques telles que la malate déshydrogénase (MDH) dans la matrice est sensible au potentiel membranaire car elle peut être inhibée par la valinomycine, un découpleur de la chaîne respiratoire (Figure 2A…

Discussion

Les mitochondries dépendent uniquement de l’expression et de la coordination des génomes nucléaire et mitochondrial pour leur synthèse et leur expansion dans les cellules. Cependant, le génome nucléaire code la grande majorité (99%) du protéome mitochondrial, ce qui souligne l’importance de la machinerie d’importation des protéines pour soutenir la biogenèse mitochondriale. L’importation sert également d’événement de signalisation important, car le défaut d’importation peut favoriser l’initiat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr G.C. Shore de l’Université McGill, le Dr A. Strauss de la Washington School of Medicine et le Dr .M.T. Ryan de l’Université La Trobe pour les dons originaux de plasmides d’expression qui ont été utilisés pour cette recherche. Ces travaux ont été soutenus par un financement du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) à D. A. Hood. D. A. Hood est également titulaire d’une chaire de recherche du Canada en physiologie cellulaire.

Materials

0.2% BSA Sigma A2153
35S-methionine Perkin Elmer NEG709A500UC Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP Sigma A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper Thermo Fisher 05-714-5
Cassette for film Kodak Kodak Xomatic
Centrifugation Tube Thermo Fisher 3138-0050
Chloroform Thermo Fisher C298-4
DTT Sigma D9779-5G
EDTA BioShop EDT002
EGTA Sigma E4378
Gel Dryer BioRad Model 583
Gel Drying Kit Sigma or BioRad Z377570-1PAK or OW-GDF-10 Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol Caledon Laboratory Chemicals 5350-1-40
HEPES Sigma H3375
High Speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer IKA T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol Sigma I9392
KAc BioShop POA301.500
KCl Sigma P3911
M7G New England Biolab S1404S Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl BioShop MAG510
MgSO4 Thermo Fisher M65-500
MOPS BioShop MOP001
NaCl BioShop SOD001
NTP Thermo Fisher R0191
OCT Plasmid Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol Sigma P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol Sigma P3803 Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film Fujifilm BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate Promega L4960 Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin Promega N2311
Rotor for High Speed Centrifuge Beckman Coulter JA-25.50
SDS BioShop SDS001.500 Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate Bioshop SAA 304
Sodium Carbonate VWR BDH9284
Sodium salicylate Millipore Sigma 106601
Sorbitol Sigma S6021
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
Spectrophotometer Thermo Fisher Nanodrop 2000
Spermidine Sigma S-2626
Sucrose BioShop SUC507
T7 RNA Polymerase Promega P2075
Tabletop Centrifuge Thermo Fisher AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid Thermo Fisher A322-500
Tris BioShop TRS001
β-mercaptoethanol Sigma M6250-100ML

References

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria – A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Play Video

Cite This Article
Oliveira, A. N., Richards, B. J., Hood, D. A. Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria. J. Vis. Exp. (179), e63055, doi:10.3791/63055 (2022).

View Video