Summary

قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

Published: January 07, 2022
doi:

Summary

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الرئيسية التي تظهر مستوى عال من اللدونة الظاهرية في العضلات الهيكلية. استيراد البروتينات من السيتوسول هو مسار حاسم للتكوين الحيوي للعضيات ، وهو ضروري لتوسيع الشبكة والحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا. لذلك ، فإن استيراد البروتين بمثابة مقياس للصحة الخلوية.

Abstract

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية والتنظيمية الرئيسية التي تحدد إمدادات الطاقة وكذلك الصحة العامة للخلية. في العضلات الهيكلية ، توجد الميتوكوندريا في سلسلة من المورفولوجيا المعقدة ، بدءا من العضيات البيضاوية الصغيرة إلى شبكة واسعة تشبه الشبكية. لطالما كان فهم كيفية توسع شبكة الميتوكوندريا وتطورها استجابة للمحفزات المتنوعة مثل التغيرات في الطلب على الطاقة موضوعا للبحث. أحد الجوانب الرئيسية لهذا النمو ، أو التكوين الحيوي ، هو استيراد بروتينات السلائف ، المشفرة أصلا بواسطة الجينوم النووي ، والتي يتم تصنيعها في السيتوسول ، ونقلها إلى مقصورات فرعية مختلفة من الميتوكوندريا. طورت الميتوكوندريا آلية متطورة لعملية الاستيراد هذه ، تتضمن العديد من قنوات الغشاء الداخلية والخارجية الانتقائية ، والمعروفة باسم آلة استيراد البروتين (PIM). يعتمد الاستيراد إلى الميتوكوندريون على إمكانات الغشاء القابلة للحياة وتوافر ATP المشتق من العضيات من خلال الفسفرة التأكسدية. لذلك يمكن أن يكون قياسه بمثابة مقياس لصحة العضيات. يظهر PIM أيضا مستوى عاليا من اللدونة التكيفية في العضلات الهيكلية التي ترتبط بإحكام بحالة الطاقة للخلية. على سبيل المثال ، ثبت أن التدريب على التمرين يزيد من قدرة الاستيراد ، في حين أن عدم استخدام العضلات يقلل من ذلك ، ويتزامن ذلك مع التغيرات في علامات محتوى الميتوكوندريا. على الرغم من أن استيراد البروتين هو خطوة حاسمة في التكوين الحيوي وتوسع الميتوكوندريا ، إلا أن العملية لم تدرس على نطاق واسع في العضلات الهيكلية. وبالتالي ، توضح هذه الورقة كيفية استخدام الميتوكوندريا المعزولة والتي تعمل بكامل طاقتها من العضلات الهيكلية لقياس قدرة استيراد البروتين من أجل تعزيز فهم أكبر للطرق المعنية وتقدير أهمية مسار دوران العضيات في التمرين والصحة والمرض.

Introduction

الميتوكوندريا هي عضيات موجودة في مورفولوجيا معقدة في أنواع مختلفة من الخلايا ومن المسلم به أنها تمتلك مجموعة متزايدة من الوظائف التي تعتبر حاسمة للصحة الخلوية. على هذا النحو ، لم يعد من الممكن تقليصها إلى مجرد عضيات منتجة للطاقة. الميتوكوندريا هي منظمات التمثيل الغذائي الرئيسية ، ومحددات مصير الخلية ، ومحاور الإشارات ، والتي يمكن أن تكون وظائفها بمثابة مؤشرات مفيدة للصحة الخلوية العامة. في خلايا العضلات الهيكلية، تكشف دراسات المجهر الإلكتروني عن وجود ميتوكوندريا تحت الساركوليمال (SS) والميتوكوندريا بين العضلات (IMF) المتميزة جغرافيا، والتي تظهر درجة من الاتصال1،2،3،4 والتي من المسلم به الآن أنها ديناميكية للغاية وقابلة للتكيف مع التغيرات في مستويات نشاط العضلات الهيكلية، وكذلك مع التقدم في العمر والمرض. يمكن تقييم محتوى الميتوكوندريا ووظيفتها في العضلات بطرق عديدة5,6 ، وتم تطبيق الطرق التقليدية لعزل العضيات لفهم أفضل للقدرات التنفسية والأنزيمية (Vmax) للميتوكوندريا المتميزة عن تأثير الوسط الخلوي7,8. على وجه الخصوص ، كشفت هذه الطرق التقليدية عن فروق كيميائية حيوية خفية بين الميتوكوندريا المعزولة من المناطق تحت الساركوليمية وبين الرجفان العضلي ، مما يكذب الآثار الوظيفية المحتملة لعملية التمثيل الغذائي في هذه المناطق تحت الخلوية8،9،10،11.

التكوين الحيوي للميتوكوندريا فريد من نوعه في طلب مساهمة المنتجات الجينية من كل من الحمض النووي النووي والميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى منها مشتقة من النواة لأن نسخ mtDNA يؤدي فقط إلى تخليق 13 بروتينا. نظرا لأن الميتوكوندريا تتكون عادة من >1000 بروتين مشارك في مسارات استقلابية متنوعة ، فإن التكوين الحيوي للعضية يتطلب وسيلة منظمة بإحكام لاستيراد وتجميع بروتينات السلائف من السيتوسول إلى المقصورات الفرعية المختلفة للميتوكوندريا للحفاظ على قياس الستويشيومتري السليم والوظيفة12,13. عادة ما تحمل البروتينات المشفرة نوويا الموجهة للميتوكوندريا تسلسل استهداف الميتوكوندريا (MTS) الذي يستهدفها إلى العضية ويسهل توطينها دون الجزئي. تحتوي معظم البروتينات المرتبطة بالمصفوفة على MTS طرف N قابل للشق، في حين أن تلك الموجهة إلى غشاء الميتوكوندريا الخارجي أو الداخلي عادة ما يكون لها مجالات استهداف داخلية14. تتم عملية الاستيراد من خلال مجموعة من القنوات المتنوعة التي توفر طرقا متعددة للدخول إلى العضية13. ينقل ترانسلوكاس الغشاء الخارجي (TOM) المعقد السلائف من السيتوسول إلى الفضاء بين الغشاء ، حيث يتم التعرف عليها بواسطة ترانسلوكيس مجمع الغشاء الداخلي (TIM). وهذا المجمع مسؤول عن استيراد السلائف المشفرة نوويا إلى المصفوفة، حيث تشق البروتياز التسلسل المسبق للاستهداف الطرفي N. يمكن إدخال البروتينات الموجهة للغشاء الخارجي مباشرة في هذا الغشاء من خلال مجمع TOM ، في حين يتم إدخال البروتينات الموجهة للغشاء الداخلي بواسطة بروتين TIM ، وتحديدا TIM22. بعد استيرادها ، تتم معالجة البروتينات بشكل أكبر بواسطة البروتيازات والمرافقين المقيمين وغالبا ما تتحد لتشكيل مجمعات أكبر ، مثل تلك الموجودة في سلسلة نقل الإلكترونات.

استيراد بروتين الميتوكوندريا نفسه يعمل أيضا كقياس لصحة الميتوكوندريا ، حيث تعتمد هذه العملية على وجود إمكانات الغشاء ومصدر للطاقة في شكل ATP15. على سبيل المثال ، عندما يتم تبديد إمكانات الغشاء ، لا يمكن تناول بروتين كيناز PINK1 بواسطة العضية ، وهذا يؤدي إلى إشارات الفسفرة التي تؤدي إلى بداية تدهور العضية من خلال مسار يسمى mitophagy16,17. وفي ظل ظروف مماثلة، عندما يعوق الاستيراد، لا يمكن للبروتين ATF5 أن يدخل العضية، ثم ينتقل بعد ذلك إلى النواة، حيث يعمل كعامل نسخ للتنظيم الأعلى للتعبير الجيني للاستعراض الدوري الشامل18،19. وبالتالي ، يمكن أن يوفر قياس كفاءة استيراد البروتين نظرة شاملة على صحة العضية ، في حين يمكن استخدام استجابة التعبير الجيني للإشارة إلى درجة الإشارات الرجعية إلى النواة.

على الرغم من أهميته الواضحة للتكوين الحيوي للميتوكوندريا وللصحة الخلوية بشكل عام ، إلا أن مسار الاستيراد في الميتوكوندريا الثديية غير مدروس بشكل ملحوظ. في هذا التقرير، نصف الخطوات المحددة التي ينطوي عليها قياس استيراد بروتينات السلائف إلى الميتوكوندريا العضلية الهيكلية ونقدم بيانات لتوضيح الاستجابة التكيفية لنظام الاستيراد للتغيرات في العضلات وعدم استخدامها، مما يوضح مساهمة استيراد البروتين في اللدونة التكيفية للعضلات الهيكلية.

Protocol

يتم الحفاظ على جميع الحيوانات المستخدمة في هذه التجارب في مرفق رعاية الحيوانات في جامعة يورك. يتم إجراء التجارب وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوان بجامعة يورك (التصريح: 2017-08). 1. العزل الوظيفي للميتوكوندريا تحت الساركوليمال وبين الرجفان ال?…

Representative Results

لقد أوضحنا على نطاق واسع أن هذا البروتوكول هو فحص صالح لتحديد معدل الاستيراد إلى الميتوكوندريا العضلية المعزولة الوظيفية والسليمة. وبالمقارنة مع الظروف غير المعالجة، فإن استيراد بروتينات السلائف النموذجية مثل نازعة هيدروجيناز مالات (MDH) إلى المصفوفة أمر حساس لإمكانات الغشاء لأنه يمكن ت?…

Discussion

تعتمد الميتوكوندريا بشكل فريد على التعبير والتنسيق بين كل من الجينوم النووي والميتوكوندريا لتخليقها وتوسعها داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن الجينوم النووي يشفر الغالبية العظمى (99 ٪) من بروتيوم الميتوكوندريا ، وهذا يؤكد أهمية آلية استيراد البروتين في دعم التكوين الحيوي للميتوكوندريا. يعمل ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ج.C. شور من جامعة ماكجيل ، والدكتور أ. شتراوس من كلية واشنطن للطب ، والدكتور .M. ت. ريان من جامعة لا تروب على التبرعات الأصلية من بلازميدات التعبير التي استخدمت في هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) إلى D. A. Hood. D. A. Hood هو أيضا حامل كرسي أبحاث كندا في فسيولوجيا الخلية.

Materials

0.2% BSA Sigma A2153
35S-methionine Perkin Elmer NEG709A500UC Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP Sigma A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper Thermo Fisher 05-714-5
Cassette for film Kodak Kodak Xomatic
Centrifugation Tube Thermo Fisher 3138-0050
Chloroform Thermo Fisher C298-4
DTT Sigma D9779-5G
EDTA BioShop EDT002
EGTA Sigma E4378
Gel Dryer BioRad Model 583
Gel Drying Kit Sigma or BioRad Z377570-1PAK or OW-GDF-10 Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol Caledon Laboratory Chemicals 5350-1-40
HEPES Sigma H3375
High Speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer IKA T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol Sigma I9392
KAc BioShop POA301.500
KCl Sigma P3911
M7G New England Biolab S1404S Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl BioShop MAG510
MgSO4 Thermo Fisher M65-500
MOPS BioShop MOP001
NaCl BioShop SOD001
NTP Thermo Fisher R0191
OCT Plasmid Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol Sigma P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol Sigma P3803 Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film Fujifilm BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate Promega L4960 Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin Promega N2311
Rotor for High Speed Centrifuge Beckman Coulter JA-25.50
SDS BioShop SDS001.500 Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate Bioshop SAA 304
Sodium Carbonate VWR BDH9284
Sodium salicylate Millipore Sigma 106601
Sorbitol Sigma S6021
SP6 RNA Polymerase Promega P1085
Spectrophotometer Thermo Fisher Nanodrop 2000
Spermidine Sigma S-2626
Sucrose BioShop SUC507
T7 RNA Polymerase Promega P2075
Tabletop Centrifuge Thermo Fisher AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid Thermo Fisher A322-500
Tris BioShop TRS001
β-mercaptoethanol Sigma M6250-100ML

References

  1. Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).
  2. Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).
  3. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).
  4. Ogata, T., Yamasaki, Y. Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers. Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).
  5. Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis. Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).
  6. Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).
  7. Holloszy, J. O. Biochemical adaptations in muscle. The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).
  8. Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions. The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).
  9. Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).
  10. Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria. Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).
  11. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).
  12. Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins. Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).
  13. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).
  14. Backes, S., Herrmann, J. M. Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces. Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).
  15. Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. The protein import machinery of mitochondria – A regulatory hub in metabolism, stress, and disease. Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).
  16. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).
  17. Matsuda, N., et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy. The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).
  18. Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR. Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).
  19. Quiros, P. M., et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals. The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).
  20. Takahashi, M., Hood, D. A. Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions. The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).
  21. Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging. Annual Review of Physiology. 81, (2019).
  22. Joseph, A., Hood, D. A. Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity. Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).
  23. Singh, K., Hood, D. A. Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).
  24. Zhang, Y., et al. Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).
  25. Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).
  26. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science. 337 (6094), 587-590 (2012).
  27. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: Isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  28. Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling. Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).
  29. Sánchez-Duarte, E., et al. Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria. Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).
  30. Iñigo, M. R., et al. Estrogen receptor-α in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).
  31. Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).
  32. Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system. The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).
  33. Kravic, B., et al. In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy. Autophagy. 8627, 01-65 (2017).
  34. Opalińska, M., Meisinger, C. Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery. Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).
  35. Gerbeth, C., et al. Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases. Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).

Play Video

Cite This Article
Oliveira, A. N., Richards, B. J., Hood, D. A. Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria. J. Vis. Exp. (179), e63055, doi:10.3791/63055 (2022).

View Video