الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الرئيسية التي تظهر مستوى عال من اللدونة الظاهرية في العضلات الهيكلية. استيراد البروتينات من السيتوسول هو مسار حاسم للتكوين الحيوي للعضيات ، وهو ضروري لتوسيع الشبكة والحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا. لذلك ، فإن استيراد البروتين بمثابة مقياس للصحة الخلوية.
الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية والتنظيمية الرئيسية التي تحدد إمدادات الطاقة وكذلك الصحة العامة للخلية. في العضلات الهيكلية ، توجد الميتوكوندريا في سلسلة من المورفولوجيا المعقدة ، بدءا من العضيات البيضاوية الصغيرة إلى شبكة واسعة تشبه الشبكية. لطالما كان فهم كيفية توسع شبكة الميتوكوندريا وتطورها استجابة للمحفزات المتنوعة مثل التغيرات في الطلب على الطاقة موضوعا للبحث. أحد الجوانب الرئيسية لهذا النمو ، أو التكوين الحيوي ، هو استيراد بروتينات السلائف ، المشفرة أصلا بواسطة الجينوم النووي ، والتي يتم تصنيعها في السيتوسول ، ونقلها إلى مقصورات فرعية مختلفة من الميتوكوندريا. طورت الميتوكوندريا آلية متطورة لعملية الاستيراد هذه ، تتضمن العديد من قنوات الغشاء الداخلية والخارجية الانتقائية ، والمعروفة باسم آلة استيراد البروتين (PIM). يعتمد الاستيراد إلى الميتوكوندريون على إمكانات الغشاء القابلة للحياة وتوافر ATP المشتق من العضيات من خلال الفسفرة التأكسدية. لذلك يمكن أن يكون قياسه بمثابة مقياس لصحة العضيات. يظهر PIM أيضا مستوى عاليا من اللدونة التكيفية في العضلات الهيكلية التي ترتبط بإحكام بحالة الطاقة للخلية. على سبيل المثال ، ثبت أن التدريب على التمرين يزيد من قدرة الاستيراد ، في حين أن عدم استخدام العضلات يقلل من ذلك ، ويتزامن ذلك مع التغيرات في علامات محتوى الميتوكوندريا. على الرغم من أن استيراد البروتين هو خطوة حاسمة في التكوين الحيوي وتوسع الميتوكوندريا ، إلا أن العملية لم تدرس على نطاق واسع في العضلات الهيكلية. وبالتالي ، توضح هذه الورقة كيفية استخدام الميتوكوندريا المعزولة والتي تعمل بكامل طاقتها من العضلات الهيكلية لقياس قدرة استيراد البروتين من أجل تعزيز فهم أكبر للطرق المعنية وتقدير أهمية مسار دوران العضيات في التمرين والصحة والمرض.
الميتوكوندريا هي عضيات موجودة في مورفولوجيا معقدة في أنواع مختلفة من الخلايا ومن المسلم به أنها تمتلك مجموعة متزايدة من الوظائف التي تعتبر حاسمة للصحة الخلوية. على هذا النحو ، لم يعد من الممكن تقليصها إلى مجرد عضيات منتجة للطاقة. الميتوكوندريا هي منظمات التمثيل الغذائي الرئيسية ، ومحددات مصير الخلية ، ومحاور الإشارات ، والتي يمكن أن تكون وظائفها بمثابة مؤشرات مفيدة للصحة الخلوية العامة. في خلايا العضلات الهيكلية، تكشف دراسات المجهر الإلكتروني عن وجود ميتوكوندريا تحت الساركوليمال (SS) والميتوكوندريا بين العضلات (IMF) المتميزة جغرافيا، والتي تظهر درجة من الاتصال1،2،3،4 والتي من المسلم به الآن أنها ديناميكية للغاية وقابلة للتكيف مع التغيرات في مستويات نشاط العضلات الهيكلية، وكذلك مع التقدم في العمر والمرض. يمكن تقييم محتوى الميتوكوندريا ووظيفتها في العضلات بطرق عديدة5,6 ، وتم تطبيق الطرق التقليدية لعزل العضيات لفهم أفضل للقدرات التنفسية والأنزيمية (Vmax) للميتوكوندريا المتميزة عن تأثير الوسط الخلوي7,8. على وجه الخصوص ، كشفت هذه الطرق التقليدية عن فروق كيميائية حيوية خفية بين الميتوكوندريا المعزولة من المناطق تحت الساركوليمية وبين الرجفان العضلي ، مما يكذب الآثار الوظيفية المحتملة لعملية التمثيل الغذائي في هذه المناطق تحت الخلوية8،9،10،11.
التكوين الحيوي للميتوكوندريا فريد من نوعه في طلب مساهمة المنتجات الجينية من كل من الحمض النووي النووي والميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى منها مشتقة من النواة لأن نسخ mtDNA يؤدي فقط إلى تخليق 13 بروتينا. نظرا لأن الميتوكوندريا تتكون عادة من >1000 بروتين مشارك في مسارات استقلابية متنوعة ، فإن التكوين الحيوي للعضية يتطلب وسيلة منظمة بإحكام لاستيراد وتجميع بروتينات السلائف من السيتوسول إلى المقصورات الفرعية المختلفة للميتوكوندريا للحفاظ على قياس الستويشيومتري السليم والوظيفة12,13. عادة ما تحمل البروتينات المشفرة نوويا الموجهة للميتوكوندريا تسلسل استهداف الميتوكوندريا (MTS) الذي يستهدفها إلى العضية ويسهل توطينها دون الجزئي. تحتوي معظم البروتينات المرتبطة بالمصفوفة على MTS طرف N قابل للشق، في حين أن تلك الموجهة إلى غشاء الميتوكوندريا الخارجي أو الداخلي عادة ما يكون لها مجالات استهداف داخلية14. تتم عملية الاستيراد من خلال مجموعة من القنوات المتنوعة التي توفر طرقا متعددة للدخول إلى العضية13. ينقل ترانسلوكاس الغشاء الخارجي (TOM) المعقد السلائف من السيتوسول إلى الفضاء بين الغشاء ، حيث يتم التعرف عليها بواسطة ترانسلوكيس مجمع الغشاء الداخلي (TIM). وهذا المجمع مسؤول عن استيراد السلائف المشفرة نوويا إلى المصفوفة، حيث تشق البروتياز التسلسل المسبق للاستهداف الطرفي N. يمكن إدخال البروتينات الموجهة للغشاء الخارجي مباشرة في هذا الغشاء من خلال مجمع TOM ، في حين يتم إدخال البروتينات الموجهة للغشاء الداخلي بواسطة بروتين TIM ، وتحديدا TIM22. بعد استيرادها ، تتم معالجة البروتينات بشكل أكبر بواسطة البروتيازات والمرافقين المقيمين وغالبا ما تتحد لتشكيل مجمعات أكبر ، مثل تلك الموجودة في سلسلة نقل الإلكترونات.
استيراد بروتين الميتوكوندريا نفسه يعمل أيضا كقياس لصحة الميتوكوندريا ، حيث تعتمد هذه العملية على وجود إمكانات الغشاء ومصدر للطاقة في شكل ATP15. على سبيل المثال ، عندما يتم تبديد إمكانات الغشاء ، لا يمكن تناول بروتين كيناز PINK1 بواسطة العضية ، وهذا يؤدي إلى إشارات الفسفرة التي تؤدي إلى بداية تدهور العضية من خلال مسار يسمى mitophagy16,17. وفي ظل ظروف مماثلة، عندما يعوق الاستيراد، لا يمكن للبروتين ATF5 أن يدخل العضية، ثم ينتقل بعد ذلك إلى النواة، حيث يعمل كعامل نسخ للتنظيم الأعلى للتعبير الجيني للاستعراض الدوري الشامل18،19. وبالتالي ، يمكن أن يوفر قياس كفاءة استيراد البروتين نظرة شاملة على صحة العضية ، في حين يمكن استخدام استجابة التعبير الجيني للإشارة إلى درجة الإشارات الرجعية إلى النواة.
على الرغم من أهميته الواضحة للتكوين الحيوي للميتوكوندريا وللصحة الخلوية بشكل عام ، إلا أن مسار الاستيراد في الميتوكوندريا الثديية غير مدروس بشكل ملحوظ. في هذا التقرير، نصف الخطوات المحددة التي ينطوي عليها قياس استيراد بروتينات السلائف إلى الميتوكوندريا العضلية الهيكلية ونقدم بيانات لتوضيح الاستجابة التكيفية لنظام الاستيراد للتغيرات في العضلات وعدم استخدامها، مما يوضح مساهمة استيراد البروتين في اللدونة التكيفية للعضلات الهيكلية.
تعتمد الميتوكوندريا بشكل فريد على التعبير والتنسيق بين كل من الجينوم النووي والميتوكوندريا لتخليقها وتوسعها داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن الجينوم النووي يشفر الغالبية العظمى (99 ٪) من بروتيوم الميتوكوندريا ، وهذا يؤكد أهمية آلية استيراد البروتين في دعم التكوين الحيوي للميتوكوندريا. يعمل ال…
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ج.C. شور من جامعة ماكجيل ، والدكتور أ. شتراوس من كلية واشنطن للطب ، والدكتور .M. ت. ريان من جامعة لا تروب على التبرعات الأصلية من بلازميدات التعبير التي استخدمت في هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) إلى D. A. Hood. D. A. Hood هو أيضا حامل كرسي أبحاث كندا في فسيولوجيا الخلية.
0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
35S-methionine | Perkin Elmer | NEG709A500UC | Purchase requires a valid radioisotope permit |
ATP | Sigma | A7699 | |
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
Cassette for film | Kodak | Kodak Xomatic | |
Centrifugation Tube | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
Chloroform | Thermo Fisher | C298-4 | |
DTT | Sigma | D9779-5G | |
EDTA | BioShop | EDT002 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Gel Dryer | BioRad | Model 583 | |
Gel Drying Kit | Sigma or BioRad | Z377570-1PAK or OW-GDF-10 | Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples. |
Glycerol | Caledon Laboratory Chemicals | 5350-1-40 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 Centrifuge | |
Homogenizer | IKA | T25 Digital Ultra Turrex | |
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol | Sigma | I9392 | |
KAc | BioShop | POA301.500 | |
KCl | Sigma | P3911 | |
M7G | New England Biolab | S1404S | Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock |
MgCl | BioShop | MAG510 | |
MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
MOPS | BioShop | MOP001 | |
NaCl | BioShop | SOD001 | |
NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
OCT Plasmid | – | – | Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877 |
pGEM4Z/hTom40 Plasmid | – | – | Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia |
pGMDH Plasmid | – | – | Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine |
Phenol | Sigma | P4557 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | Can also be made with the ratio provided |
Phosphorus Film | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
Rabbit reticulocyte lysate | Promega | L4960 | Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well |
RNAsin | Promega | N2311 | |
Rotor for High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
SDS | BioShop | SDS001.500 | Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask. |
Sodium acetate | Bioshop | SAA 304 | |
Sodium Carbonate | VWR | BDH9284 | |
Sodium salicylate | Millipore Sigma | 106601 | |
Sorbitol | Sigma | S6021 | |
SP6 RNA Polymerase | Promega | P1085 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
Spermidine | Sigma | S-2626 | |
Sucrose | BioShop | SUC507 | |
T7 RNA Polymerase | Promega | P2075 | |
Tabletop Centrifuge | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
Tris | BioShop | TRS001 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M6250-100ML |