Ein Explantationssystem für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der olfaktorischen Schaltkreismontage bei Drosophila

Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Seit über 100 Jahren versuchen Neurowissenschaftler zu verstehen, wie sich Neuriten mit extremer Präzision auf ihre Zwischen- und Endziele ausdehnen. Infolgedessen haben sie wichtige Gene identifiziert, die Leitfäden für die Entwicklung neuronaler Prozesse^{kodieren 1}. Das olfaktorische System von Drosophila bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da olfaktorische Rezeptorneuronen (ORNs, die primären sensorischen Neuronen) auf 50 identifizierbare Glomeruli mit stereotyper Größe, Form und relativer Position projizieren, wo sie synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden, von denen jeder Dendriten an einen der 50 Glomeruli² sendet (Abbildung 1A ). Daher ist es relativ einfach, mutierte Phänotypen bei synaptischer (glomerulärer) Auflösung im olfaktorischen Fliegensystem zu identifizieren. Dies führte zur Entdeckung wichtiger Gene, die die olfaktorische Schaltkreismontage^{regulieren 3}.

Der Aufbau des olfaktorischen Flugkreislaufs beruht auf zeitlich und räumlich koordinierten Entwicklungsprozessen³. ORNs und PNs erwerben unterschiedliche Zellschicksale, die das Programm für ihre Verdrahtungsspezifika einrichten. Als nächstes mustern PN-Dendriten den Antennenlappen vor (Abbildung 1B). Die Axone von ORNs umrunden dann den ipsilateralen Antennenlappen und überqueren die Mittellinie des Gehirns, um den kontralateralen Antennenlappen zu erreichen. Anschließend dringen ORN-Axone sowohl in ipsi- als auch in kontralaterale Antennenlappen ein und bilden Synapsen mit Dendriten ihrer Partner-PNs in spezifischen Glomeruli. Dieses grobe Modell für die olfaktorische Schaltungsmontage wurde auf der Grundlage der Charakterisierung fester Proben aus Zwischenzeitpunkten während der Entwicklung vorgeschlagen. Die schlechte zeitliche Auflösung und die Unfähigkeit, den gleichen neuronalen Prozessen während der gesamten Entwicklung aus festem Gewebe zu folgen, schränken das mechanistische Verständnis des Schaltkreismontageprozesses ein.

Es ist technisch schwierig, ORN- und PN-Prozesse in vivo live abzubilden, da der Verdrahtungsprozess in der ersten Hälfte des Puppenstadiums stattfindet, wenn der Antennenlappen von einem undurchsichtigen Fettkörper im Puppengehäuse umgeben ist. Es ist daher unmöglich, den sich entwickelnden olfaktorischen Kreislauf direkt von intakten Puppen abzubilden. Ex-vivo kultiviertes seziertes Gewebe kann die Opazität des Gewebes umgehen und wurde erfolgreich zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung^eingesetzt 4,5,6. Die Herausforderung bei der Verwendung einer ähnlichen Ex-vivo-Explantationskulturstrategie zur Untersuchung der neuronalen Verdrahtung im Puppengehirn besteht darin, ob sie das genaue Neuronen-Targeting in einem Kulturzustand rekapituliert. Basierend auf einer zuvor berichteten Ex-vivo-Kulturbedingung für den Fliegenaugehirn-Komplex⁷ wurde kürzlich ein Explantat entwickelt, das das gesamte Puppengehirn, die Antennen und die verbindenden Antennennerven intakt enthält, das eine präzise Ausrichtung des olfaktorischen Schaltkreises beibehält und einer Zwei-Photonen-Mikroskopie-basierten Live-Bildgebung für bis zu 24 h mit einer Frequenz von jeweils 20 min^{unterzogen werden kann 8} . Hier wird ein detailliertes Protokoll der Explantierkultur und Bildgebung beschrieben. Das Explant-System bietet eine leistungsstarke Methode, um den Aufbau des olfaktorischen Schaltkreises und möglicherweise anderer Schaltkreise im zentralen Gehirn zu untersuchen.