Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila
Summary
Dit protocol beschrijft de dissectieprocedure, kweekconditie en live beeldvorming van een antenne-hersenexplantatiesysteem voor de studie van de olfactorische circuitassemblage.
Abstract
Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de juiste functie van de hersenen. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien 50 soorten olfactorische receptorneuronen (ORN’s) van de antennes en maxillaire palpen hun axonen projecteren op 50 identificeerbare glomeruli in de antennekwab en synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR’s). Eerdere studies richtten zich vooral op het identificeren van belangrijke moleculen die de precieze targeting in het olfactorische circuit reguleren met behulp van vaste weefsels. Hier wordt een antenne-hersenexplantatiesysteem beschreven dat belangrijke ontwikkelingsmijlpalen van olfactorische circuitassemblage in cultuur samenvat. Door de externe cuticula te ontleden en ondoorzichtige vetlichamen te reinigen die het zich ontwikkelende popbrein bedekken, kunnen hoogwaardige beelden van afzonderlijke neuronen uit levende hersenen worden verzameld met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Dit maakt time-lapse beeldvorming mogelijk van enkele ORN axon targeting uit levend weefsel. Deze aanpak zal helpen bij het onthullen van belangrijke celbiologische contexten en functies van eerder geïdentificeerde belangrijke genen en het identificeren van mechanismen die ten grondslag liggen aan het dynamische proces van circuitassemblage.
Introduction
Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de goede werking van de hersenen. Al meer dan 100 jaar proberen neurowetenschappers met extreme precisie te begrijpen hoe neurieten zich uitstrekken naar hun tussen- en einddoelen. Als gevolg hiervan hebben ze belangrijke genen geïdentificeerd die coderen voor aanwijzingen voor het ontwikkelen van neuronale processen1. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien olfactorische receptorneuronen (ORN’s, de primaire sensorische neuronen) projecteren op 50 identificeerbare glomeruli met stereotiepe grootte, vorm en relatieve positie, waar ze synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR’s), die elk dendrieten naar een van de 50 glomeruli2 sturen (figuur 1A ). Daarom is het relatief eenvoudig om gemuteerde fenotypen te identificeren bij synaptische (glomerulaire) resolutie in het reuksysteem van de vlieg. Dit leidde tot ontdekkingen van belangrijke genen die de assemblage van olfactorische circuitsreguleren 3.
De assemblage van het reukcircuit van de vlieg is afhankelijk van temporeel en ruimtelijk gecoördineerde ontwikkelingsprocessen3. ORN’s en PN’s krijgen verschillende celbestemmingen, die het programma opzetten voor hun bedradingsspecifieke kenmerken. Vervolgens prepatriëren PN-dendrieten de antennekwab (figuur 1B). De axonen van ORN’s omcirkelen vervolgens de ipsilaterale antennekwab en kruisen de middellijn van de hersenen om de contralaterale antennekwab te bereiken. Vervolgens dringen ORN-axonen zowel ipsi- als contralaterale antennelobben binnen en vormen synapsen met dendrieten van hun partner-PR’s in specifieke glomeruli. Dit grove model voor olfactorische circuitassemblage werd voorgesteld op basis van de karakterisering van vaste monsters uit tussenliggende tijdspunten tijdens de ontwikkeling. De slechte temporele resolutie en het onvermogen om dezelfde neuronale processen te volgen tijdens de ontwikkeling van vast weefsel beperken het mechanistische begrip van het circuitassemblageproces.
Het is technisch een uitdaging om ORN- en PN-processen in vivo te leven, omdat het bedradingsproces plaatsvindt in de eerste helft van het popstadium wanneer de antennekwab wordt omringd door ondoorzichtig vetlichaam in de pop. Het is daarom onmogelijk om het zich ontwikkelende reukcircuit van intacte poppen direct in beeld te brengen. Ontleedde weefsels die ex vivo zijn gekweekt, kunnen weefselopaciteit omzeilen en zijn met succes gebruikt om de neurale ontwikkeling tebestuderen 4,5,6. De uitdaging van het gebruik van een vergelijkbare ex vivo explantcultuurstrategie om neuronale bedrading in het popbrein te bestuderen, is of het de precieze neurontargeting in een cultuurconditie samenvat. Op basis van een eerder gerapporteerde ex vivo kweekconditie voor het fly eye-brain complex7, is onlangs een explant ontwikkeld die het hele popbrein, antennes en de verbindende antennezenuwen intact bevat, die nauwkeurige targeting van het reukcircuit behoudt en kan worden onderworpen aan op twee fotonenmicroscopie gebaseerde live beeldvorming tot 24 uur met de frequentie van elke 20 min8 . Hier wordt een gedetailleerd protocol van de explantcultuur en beeldvorming beschreven. Het explantingsysteem biedt een krachtige methode om de assemblage van olfactorische circuits en mogelijk andere circuits in de centrale hersenen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Drosophila antenne-hersen explant behoudt normale targeting van het reukcircuit. We merkten wel dat de ontwikkeling ex vivo 2 keer langzamer gaat dan in vivo. Opgemerkt wordt dat het explant-systeem geen maxillaire palp behoudt, die zes soorten ORN’s herbergt. Om ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling ex vivo wordt samengevat, moet het uitrekken van de antennezenuwen worden vermeden tijdens explantdissectie. Tijdens ex vivo kweek veroorzaakt bacteriegroei meestal een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken N. Özel en R. Hiesinger voor hun advies over de explantcultuur; M. Wagner voor technische hulp van de twee-fotonenmicroscopie; D.J. Luginbuhl voor het genereren van transgene vliegen; D. Friedmann voor suggesties van Fiji software analyse; Y. Ge voor hulp bij vliegwerk; C. McLaughlin en K.K.L. Wong voor commentaar op het manuscript. L.L. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd ondersteund door national institutes of health grants 1K99DC01883001 (aan T.L.) en R01-DC005982 (aan L.L.).
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
