Un sistema di espianto per studi di imaging time-lapse dell'assemblaggio di circuiti olfattivi in Drosophila

I neuroni sono precisamente interconnessi per formare circuiti essenziali per il corretto funzionamento del cervello. Per oltre 100 anni, i neuroscienziati hanno cercato di capire come i neuriti si estendono verso i loro obiettivi intermedi e finali con estrema precisione. Di conseguenza, hanno identificato geni importanti che codificano segnali di guida per lo sviluppo di processi neuronali¹. Il sistema olfattivo Drosophila fornisce un modello eccellente per indagare questo processo poiché i neuroni recettori olfattivi (ORN, i neuroni sensoriali primari) proiettano a 50 glomeruli identificabili con dimensioni, forma e posizione relativa stereotipate, dove formano connessioni sinaptiche con dendriti da 50 tipi di neuroni di proiezione (PN) di secondo ordine), ognuno dei quali invia dendriti a uno dei 50 glomeruli² (Figura 1A ). Pertanto, è relativamente facile identificare fenotipi mutanti a risoluzione sinaptica (glomerulare) nel sistema olfattivo della mosca. Ciò ha portato alla scoperta di importanti geni che regolano l’assemblaggio del circuito olfattivo³.

L’assemblaggio del circuito olfattivo della mosca si basa su processi di sviluppo temporalmente e spazialmente coordinati³. ORN e PN acquisiscono destini cellulari distinti, che impostano il programma per le loro specificità di cablaggio. Successivamente, i dendriti PN prepatterano il lobo antennale (Figura 1B). Gli assoni degli ORN circumnavigano quindi il lobo antennale ipsilaterale e attraversano la linea mediana del cervello per raggiungere il lobo antennale controlaterale. Successivamente, gli assoni ORN invadono sia i lobi antennali ipsi- che controlaterali e formano sinapsi con dendriti dei loro PT partner in glomeruli specifici. Questo modello grossolano per l’assemblaggio di circuiti olfattivi è stato proposto sulla base della caratterizzazione di campioni fissi da punti temporali intermedi durante lo sviluppo. La scarsa risoluzione temporale e l’incapacità di seguire gli stessi processi neuronali attraverso lo sviluppo da tessuto fisso limitano la comprensione meccanicistica del processo di assemblaggio del circuito.

È tecnicamente difficile vivere i processi ORN e PN in vivo poiché il processo di cablaggio avviene nella prima metà dello stadio pupale quando il lobo antennale è circondato da un corpo grasso opaco all’interno della custodia pupale. È quindi impossibile visualizzare direttamente il circuito olfattivo in via di sviluppo da pupe intatte. I tessuti sezionati coltivati ex vivo possono aggirare l’opacità tissutale e sono stati utilizzati con successo per studiare lo sviluppo neurale ^4,5,6. La sfida di utilizzare una simile strategia di coltura di espianto ex vivo per studiare il cablaggio neuronale nel cervello pupale è se ricapitola il targeting preciso del neurone in una condizione di coltura. Sulla base di una condizione di coltura ex vivo precedentemente riportata per il complesso occhio-cervello della mosca⁷, è stato recentemente sviluppato un espianto che contiene intatto l’intero cervello pupale, le antenne e i nervi antennali di collegamento, che mantiene un targeting preciso del circuito olfattivo e può essere sottoposto a imaging dal vivo basato su microscopia a due fotoni per un massimo di 24 ore alla frequenza di ogni 20 min⁸ . Qui viene descritto un protocollo dettagliato della coltura e dell’imaging di espianto. Il sistema di espianto fornisce un metodo potente per studiare l’assemblaggio del circuito olfattivo e potenzialmente altri circuiti nel cervello centrale.