Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila

Os neurônios são precisamente interligados para formar circuitos essenciais para a função adequada do cérebro. Por mais de 100 anos, os neurocientistas têm tentado entender como os neuritos se estendem em direção aos seus alvos intermediários e finais com extrema precisão. Como resultado, eles identificaram genes importantes que codificam pistas de orientação para o desenvolvimento de processos neuronais¹. O sistema olfativo Drosophila fornece um excelente modelo para investigar esse processo desde os neurônios receptores olfativos (ORNs, os neurônios sensoriais primários) projetam-se para 50 glomeruli identificáveis com tamanho estereotipado, forma e posição relativa, onde formam conexões sinápticas com dendritos de 50 tipos de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs), cada um dos quais envia dendritos para um dos 50 glomeruli² (Figura 1A ). Portanto, é relativamente fácil identificar fenótipos mutantes na resolução sináptica (glomerular) no sistema olfativo de mosca. Isso levou a descobertas de genes importantes que regulam o conjunto do circuito olfativo³.

A montagem do circuito olfativo da mosca conta com processos de desenvolvimento temporal e^{espacialmente} coordenados 3. ORNs e PNs adquirem destinos celulares distintos, que configuram o programa para suas especificidades de fiação. Em seguida, dendritos PN pré-padrão do lóbulo antena (Figura 1B). Os axônios de ORNs então circunavegam o lobo antena ipsilateral e cruzam a linha média do cérebro para alcançar o lobo antena contralateral. Posteriormente, os axônios ORN invadem os lobos ipsi e contralateral das antenas e formam sinapses com dendritos de seus PNs parceiros em glomeruli específico. Este modelo grosseiro para montagem de circuito olfativo foi proposto com base na caracterização de amostras fixas a partir de pontos de tempo intermediários durante o desenvolvimento. A baixa resolução temporal e a incapacidade de seguir os mesmos processos neuronais através do desenvolvimento do tecido fixo limitam a compreensão mecanicista do processo de montagem do circuito.

É tecnicamente desafiador viver os processos orn e PN in vivo, uma vez que o processo de fiação ocorre na primeira metade da fase pupal quando o lobo antena é cercado por corpo de gordura opaco dentro da caixa pupal. É, portanto, impossível imaginar diretamente o circuito olfativo em desenvolvimento a partir de pupas intactas. Tecidos dissecados cultivados ex vivo podem contornar a opacidade tecidual e têm sido usados com sucesso para estudar o desenvolvimento neural ^4,5,6. O desafio de usar uma estratégia de cultura ex vivo ex vivo semelhante para estudar a fiação neuronal no cérebro pupal é se ele recapitula o neurônio preciso direcionado em uma condição cultural. Com base em uma condição de cultura ex vivo relatada anteriormente para o complexo olho-cérebro⁷, uma explanta que contém todo o cérebro pupal, antenas e os nervos antenas de conexão intactos foi recentemente desenvolvido, que retém alvo preciso do circuito olfativo e pode ser submetido a imagens ao vivo baseadas em microscopia de dois fótons por até 24 h na frequência de cada 20 min⁸ . Aqui, um protocolo detalhado da cultura explant e imagem é descrito. O sistema de explant fornece um método poderoso para estudar a montagem de circuito olfativo e, potencialmente, outros circuitos no cérebro central.