Drosophila'da Koku Alma Devresi Düzeneğinin Hızlandırılmış Görüntüleme Çalışmaları için Bir Explant Sistemi
Summary
Bu protokol, koku alma devresi düzeneğinin incelenmesi için diseksiyon prosedürünü, kültür durumunu ve anten-beyin eksplant sisteminin canlı görüntülenmesini açıklar.
Abstract
Nöronlar, beynin düzgün çalışması için gerekli devreleri oluşturmak için tam olarak birbirine bağlanır. Drosophila koku alma sistemi, antenlerden ve maksiller palplardan gelen 50 tip koku alma reseptör nöronu (ORN) aksonlarını anten lobunda 50 tanımlanabilir glomerüle yansıttığından ve 50 tip ikinci dereceden projeksiyon nöronundan (PN) dendritlerle sinaptik bağlantılar oluşturduğundan, bu süreci araştırmak için mükemmel bir model sunar. Önceki çalışmalar temel olarak sabit dokular kullanarak koku alma devresindeki hassas hedeflemeyi düzenleyen önemli molekülleri tanımlamaya odaklanmıştır. Burada, kültürdeki koku alma devresi düzeneğinin temel gelişimsel kilometre taşlarını özetleyen bir anten-beyin eksplant sistemi açıklanmaktadır. Dış kütikülün diseksiyonu ve gelişmekte olan pupa beynini kaplayan opak yağ cisimlerinin temizlenmesiyle, canlı beyinlerden tek nöronların yüksek kaliteli görüntüleri iki foton mikroskobu kullanılarak toplanabilir. Bu, canlı dokudan tek ORN akson hedeflemesinin hızlandırılmış görüntülenmesini sağlar. Bu yaklaşım, daha önce tanımlanmış önemli genlerin önemli hücre biyolojik bağlamlarını ve işlevlerini ortaya çıkarmaya ve devre montajının dinamik sürecini destekleyen mekanizmaları tanımlamaya yardımcı olacaktır.
Introduction
Nöronlar, beynin düzgün çalışması için gerekli devreleri oluşturmak için tam olarak birbirine bağlanır. 100 yılı aşkın bir süredir, sinirbilimciler nöritlerin orta ve nihai hedeflerine doğru nasıl aşırı hassasiyetle uzandıklarını anlamaya çalışıyorlar. Sonuç olarak, nöronal süreçlerin geliştirilmesi için rehberlik ipuçlarını kodlayan önemli genleri tanımladılar1. Drosophila koku alma sistemi, koku alma reseptör nöronları (ORN’ler, birincil duyusal nöronlar) basmakalıp boyut, şekil ve göreceli konuma sahip 50 tanımlanabilir glomerüle yansıtıldığından, her biri 50 glomerülden birine dendrit gönderen 50 tip ikinci dereceden projeksiyon nöronundan (PN’ler) dendritlerle sinaptik bağlantılar oluşturdukları için bu süreci araştırmak için mükemmel bir model sunar2 (Şekil 1A) ). Bu nedenle, sinek koku alma sisteminde sinaptik (glomerüler) çözünürlükte mutant fenotipleri tanımlamak nispeten kolaydır. Bu, koku devresi düzeneğini düzenleyen önemli genlerin keşfedilmesine yol açtı3.
Sinek koku alma devresinin montajı, geçici ve mekansal olarak koordine edilmiş gelişimsel süreçlere dayanır3. ORN’ler ve PN’ler, kablolama özgüllükleri için programı ayarlayan farklı hücre kaderleri kazanırlar. Daha sonra, PN dendritleri anten lobunu önceden şekillendirir (Şekil 1B). ORN’lerin aksonları daha sonra ipsilateral anten lobunun etrafında döner ve kontralateral anten lobuna ulaşmak için beynin orta hattını geçer. Daha sonra, ORN aksonları hem ipsi hem de kontralateral anten loblarını istila eder ve spesifik glomerüllerde partner PN’lerinin dendritleri ile sinapslar oluşturur. Koku alma devresi montajı için bu kaba model, geliştirme sırasında ara zaman noktalarından sabit numunelerin karakterizasyonuna dayanarak önerilmiştir. Zayıf zamansal çözünürlük ve sabit dokudan gelişim boyunca aynı nöronal süreçleri takip edememe, devre montaj sürecinin mekanik anlayışını sınırlar.
Görüntü ORN ve PN işlemlerini in vivo olarak yaşamak teknik olarak zordur, çünkü kablolama işlemi, anten lobunun pupa kasası içindeki opak yağ gövdesi ile çevrili olduğu pupa aşamasının ilk yarısında gerçekleşir. Bu nedenle, gelişmekte olan koku alma devresini sağlam pupalardan doğrudan görüntülemek imkansızdır. Exvivo kültürlenmiş disseke dokular doku opaklığını atlatabilir ve nöral gelişimi incelemek için başarıyla kullanılmıştır 4,5,6. Pupa beynindeki nöronal kablolamayı incelemek için benzer bir ex vivo eksplant kültürü stratejisi kullanmanın zorluğu, bir kültür durumunda kesin nöron hedeflemesini özetleyip özetlemediğidir. Sinek gözü-beyin kompleksi7 için daha önce bildirilen bir ex vivo kültür durumuna dayanarak, tüm pupa beynini, antenleri ve bağlantı anten sinirlerini bozulmadan içeren, koku alma devresinin hassas hedeflemesini koruyan ve her 20 dakikada bir 24 saate kadar iki foton mikroskopi tabanlı canlı görüntülemeye tabi tutulabilen bir eksplant yakın zamanda geliştirilmiştir8 . Burada, eksplant kültürü ve görüntülemenin ayrıntılı bir protokolü açıklanmaktadır. Eksplant sistemi, koku alma devresinin ve potansiyel olarak merkezi beyindeki diğer devrelerin montajını incelemek için güçlü bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila anten-beyin eksplantı, koku alma devresinin normal hedeflemesini korur. Gelişimin in vivo’ya kıyasla 2 kat daha yavaş ex vivo olduğunu fark ettik. Explant sisteminin, altı tip ORN’ye ev sahipliği yapan maksiller palp’ı tutmadığı belirtilmektedir. Normal gelişimin ex vivo olarak özetlenmesini sağlamak için, eksplant diseksiyonu sırasında anten sinirlerinin gerilmesinden kaçınılmalıdır. Ex vivo kültür sırasında bakteri büyümesi genellikle k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N. Özel ve R. Hiesinger’e eksplant kültürü hakkındaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz; İki foton mikroskobunun teknik yardımı için M. Wagner; Transgenik sinekler üretmek için DJ Luginbuhl; Fiji yazılım analizi önerileri için D. Friedmann; Y. Ge sinek işlerinde yardım için; C. McLaughlin ve K.K.L. Wong, el yazması hakkındaki yorumları için. L.L. bir Howard Hughes Tıp Enstitüsü araştırmacısıdır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri 1K99DC01883001 (T.L.’ye) ve R01-DC005982 (L.L.’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
