שיפור תכולת הגידול באמצעות מקרו-דיסקציה של הגידול
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה להגדלת תכולת הגידול באחוזים של דגימות רקמה משובצות פרפין קבועות פורמלין.
Abstract
נוכחותן של רקמות לא סרטניות מזהמות ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) עלולה לערער מאוד את המחקרים הגנומיים. כאן אנו מתארים מקרודיסקציה, שיטה שנועדה להגדיל את תכולת הגידול באחוזים של דגימת רקמה על ידי הסרה וסילוק של רקמות לא רצויות לפני ביצוע מיצוי חומצות גרעין במורד הזרם. בלוקי רקמת FFPE נחתכו כדי לייצר מקטעי רקמה המותקנים על החלקה של 4-5 מיקרומטר. סעיף מייצג הוגש עבור צביעת המטוקסילין ואוסין (H&E) ולאחר מכן נבדק על ידי פתולוג מוסמך. במהלך הסקירה, הפתולוג זיהה וסימן את אזורי רקמת הגידול ב- H&E. לאחר השלמתו, נעשה שימוש ב-H&E המסומן כדי להנחות כריתה של החלקים הסדרתיים שאינם מוכתמים מאותו גוש רקמה. כדי להדגים את ההשפעות של מקרו-דיסקציה, רנ”א שחולץ מתוך לימפומות של תאי B גדולים (DLBCL) שעברו ניתוח מאקרו ולא נותחו, הופעלו על בדיקת ביטוי גנים דיגיטלית המסוגלת לקבוע את תת-הסוג DLBCL ואת מצב הטרנסלוקציה של BCL2. התוצאות הראו כי מקרו-דיסקציה שינתה את תת-הסוג או את קריאות מצב הטרנסלוקציה של BCL2 ב-60% מהדגימות שנבדקו. לסיכום, מקרודיסקציה היא שיטה פשוטה ויעילה לביצוע העשרת גידולים לפני מיצוי חומצות גרעין, שתוצר שלהן יכול לשמש בביטחון במחקרים גנומיים במורד הזרם.
Introduction
רקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE), שנאספו כחלק מתהליך האבחון הקליני הרגיל ונשמרו במאגרי רקמות קליניות, מייצגות משאב עצום למחקר אנושי, כולל חקר הסרטן1. ככל שהבנתנו את המחלות האנושיות מעמיקה, מתברר יותר ויותר שמחלות, שנחשבו בעבר לישויות בודדות המבוססות על מאפיינים מורפולוגיים ואימונופנוטיפיים, מורכבות למעשה מתת-סוגים מולקולריים מובחנים הדורשים מבחני תת-טיפוס מולקולריים. כתוצאה מכך, מבחנים גנומיים בעלי רגישות גבוהה המסוגלים להבחין בתת-סוגים אלה הפכו לחשובים יותר ויותר2. למרות שרקמות FFPE ידועות בכך שהן תואמות בצורה גרועה לטכניקות גנומיות עקב בעיות הקשורות לקיבוע, ככל שהטכנולוגיה והפרוטוקולים מתפתחים, טכניקות אלה הופכות תואמות יותר ויותר לפורמט רקמה זה הנמצא בכל מקום קליני 3,4,5. עם זאת, רקמות FFPE הן לעתים קרובות תערובות של חומרים סרטניים ורקמות שאינם סרטניים, כאשר נוכחות של חומר שאינו סרטני היא לעתים קרובות לא רצויה ויכולה, אם קיים בשיעור גבוה, לערער באופן משמעותי ולהשפיע על תוצאות הניתוחים הגנומיים6. ואכן, תכולת גידול מינימלית של 60% משמשת לעתים קרובות לניתוחים כאלה, שבהם ניתן לשלול רקמות שאינן נופלות מסף זה, למרות שאחרת עמדו בקריטריונים למחקר7. זה יכול להיות בעייתי במיוחד במסגרות של מחלות נדירות, שבהן רקמות המטופלים יקרות וקשה לאסוף אותן במספרים גבוהים.
Macrodissection היא שיטה הממזערת את ההשפעות של תכולת גידול נמוכה על ידי הפחתת כמות הרקמה הרגילה3. הסרת חומר לא סרטני מבלבל כזה לפני מיצוי חומצות גרעין יכולה להגדיל באופן משמעותי את תכולת אחוז הגידול ובכך את טוהר הגידול של חומצות הגרעין המופקות. כריתת רקמות מסתמכת באופן קריטי על סקירה פתולוגית של מומחים, לפיה אזור הגידול מזוהה ומוקף על מקטע רקמה מוכתמת של המטוקסילין ואאוזין (H&E) שנוצר זה עתה על ידי פתולוג מוסמך8. לאחר מכן נעשה שימוש ב-H&E המעוגל כדי להנחות את ההסרה והאיסוף של רקמות לא רצויות ומטרה, בהתאמה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים של מקרו-דיסקציה מסקירה פתולוגית דרך קצירת רקמות כפי שבוצע במעבדת הליבה הטכנית של משאב דגימת האיידס והסרטן (ACSR) במרפאת מאיו.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמות FFPE הן לעתים קרובות תערובות הטרוגניות של רקמות גידול ולא סרטניות. בדיקות גנומיות ברגישות גבוהה הופכות שכיחות יותר ויותר הן במסגרות קליניות והן במסגרות מחקריות, אך ניתן לבלבל אותן על ידי נוכחות של רקמה מזהמת שאינה סרטנית. ואכן, תכולת גידול מינימלית של 60% מומלצת לעתים קרובות למחקרים גנומיים. אחוז הגידול יכול להיקבע על ידי אזור הרקמה שנכבש על ידי חומר הגידול או על ידי שיעור תאי הגידול בתוך הרקמה. למרות שגידול לפי אזור הוא מדד נפוץ לטוהר הגידול, הוא לא תמיד מתאר תיאור מדויק של הרקמה. שקול שתי רקמות, שתיהן עם 1000 תאים, מתוכם 500 הם תאי גידול. ברקמה A, 500 התאים שאינם סרטניים הם תאים סטרומליים עם נפחים דומים לאלה של תא הגידול. ברקמה זו, אחוז הגידול יכול להיחשב 50% הן על ידי התאים והן על ידי האזור. ברקמה B, 500 התאים שאינם סרטניים הם תאי שומן עם נפחים שהם פי 4 מזה של תא הגידול. ברקמה זו, אחוז הגידול הוא עדיין 50% לפי תאים אבל 20% לפי אזור. רקמה שלישית, רקמה C, מורכבת מ-500 תאי גידול ועוד 400 תאי שומן ו-800 תאים סטרומליים עם נפחים שהם פי 4 ופי 0.5 מתאי הגידול, בהתאמה. בהינתן ש-100 תאי שומן שווים לנפח של 800 תאים סטרומליים, אחוז הגידול של רקמה C הוא 29% לפי תאים (500/1700) אך עדיין 20% לפי אזור. רקמה D מורכבת גם מהתאים הגידוליים, השומן והסטרומליים עם יחסי נפח של 1x, 4x ו-0.1x. עם זאת, מספר התאים הוא 400, 10 ו- 720, בהתאמה. לפיכך, אחוז הגידול ברקמה D הוא 35% לפי תאים (400/1130) אך 78% לפי אזור. דוגמאות אלה הן פשטניות מדי ואינן משקפות הרכבי רקמות בעולם האמיתי, אלא מעבירות בבירור את החשיבות של הרכב הרקמות ואת ההבדל בין תכולת הגידול לפי אזור ולפי תאים. חשוב לציין, כשמדובר בהעשרת תכולת הגידול למיצוי חומצות גרעין במורד הזרם, תאיות הגידול היא התכונה החשובה יותר בשל הפוטנציאל המבלבל המוגבר של חילוץ חומר גנומי מיותר תאים שאינם סרטניים מאשר תאים סרטניים. זה לא רק מדגיש את הצורך להעריך את תכולת הגידול של רקמות במונחים של תאי אחוזים, אלא גם את הצורך לבלות רקמה לא רצויה על מנת למזער את כל ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של הרקמה שאינה סרטנית. ישנן מספר שיטות זמינות להעשרת רקמות, כאשר העיקריות שבהן הן מקרודיסקציה ומיקרו-דיסקציה.
Macrodissection, השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, היא מהירה יחסית, פשוטה ואינה דורשת ציוד יקר או מיוחד. למרות macrodissection יכול מאוד לשפר את התוכן הגידול, חשוב להבין כי זה לא לגמרי לחסל חומר שאינו גידול. מטרת המקרודיסקציה היא להעשיר את הרקמה המעניינת מספיק באמצעות הרחקה של רקמות לא רצויות על מנת להפחית את “הרעש” הנובע מרקמה לא רצויה, אשר בתורו יכול לשפר את האות של עניין מן הרקמה של עניין. לפיכך, העשרת גידול מתווכת מקרו-דיסקציה היא דרך לשפר את יחס האות לרעש על מנת לזהות טוב יותר סמנים בעלי עניין, במיוחד סמנים מולקולריים ספציפיים לגידול עם שפע נמוך או ביטוי לקוי. עם זאת, למאקרודיסקציה יש מגבלות בשל חוסר הדיוק המוצע על ידי כלים גסים כגון סכיני גילוח והיא רגישה לבעיות דיוק הנובעות מעובי הקו של סמן הפתולוג, כמו גם טעויות פוטנציאליות בעת התחקות אחר תיחום H&E של הפתולוגים. כפי שנרמז לעיל, לא ניתן להשיג 100% טוהר הגידול בשל נוכחותם של אלמנטים סטרומליים טבועים וגורמי גידול (כלומר, רקמת חיבור, פיברובלסטים סטרומליים, כלי דם, לימפוציטים תגובתיים שפירים, מקרופאגים) המוטמעים בתוך הגידול עצמו. ואכן, ממאירויות פולשניות רבות או מסתננות באופן מפוזר גורמות לתגובה סטרומלית דסמופלסטית חזקה, וכתוצאה מכך אשכולות של תאי גידול מעורבבים באופן אינטימי עם פיברובלסטים סטרומליים וסוגי תאים אחרים שאינם ניאופלסטיים; כאשר גידולים הקשורים לדפוס תגובה סטרומלי זה, כגון רקמות סרטןהלבלב 21, עשויים להפיק תועלת רבה יותר ממיקרו-דיסקציה מונחית דיגיטלית מאשר ממיקרו-דיסקציה ידנית מאשר ממיקרו-דיסקציה ידנית.
מיקרו-דיסקציה ידנית מבוצעת תחת מיקרוסקופ כדי לסייע בזיהוי, כריתה ובידוד של תאים או אוכלוסיות ספציפיות של רקמות באמצעות מחט או אזמל ויש לה יתרון של דיוק מוגבר על פנימקרו-דיסקציה 22. עם זאת, מיקרו-דיסקציה ידנית היא תהליך מייגע שחסר את העדינות הדרושה לרקמות מורכבות עם תכולת גידול נמוכה או תכונות מורכבות שאינן תואמות את הנתיחה הידנית. ניתן לנתח רקמות כאלה באמצעות שיטות אוטומטיות ברמת דיוק גבוהה כמו מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר. ואכן, הודגם כי מיקרו-דיסקציה מונחית דיגיטלית מניבה תכולת גידול באחוזים גבוהים יותר בהשוואה למקרו-דיסקציה ידנית ברקמות סרטן הלבלב23. עם זאת, החסרונות של שיטות אוטומטיות מדויקות אלה, כגון הצורך בציוד מיוחד ויקר ואנשים מיומנים מאוד, הפריעו לשילובו בתהליכי עבודה. מחקר של de Bruin et al. שהשווה את ההשפעות של מקרודיסקציה ומיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) על פרופיל ביטוי גנים מצא כי לדגימות LCM היו תפוקות RNA כוללות נמוכות (ממוצע של 30 ננוגרם) ונדרשו שני סבבים של הגברת mRNA כדי לעמוד בסף קלט ההכנה של ספריית cDNA24. החוקרים מצאו כי פרופילי ביטוי הגנים של LCM שהתקבלו הושפעו מסבבי הגברת ה-mRNA יותר מאשר פרופילים מקרו-דיסקרטיים הושפעו מתרומות סטרומליות שאינן של הגידול, והגיעו למסקנה כי ניתן להשתמש במאקרו-דיסקציה כראוי כדי ליצור נתוני ביטוי גנים אמינים24.
יתרון משמעותי של פרופיל ביטוי גנים דיגיטלי של NanoString, במיוחד כאשר עובדים עם RNA שמקורו ב-FFPE מושפל מאוד, הוא שהוא אינו דורש תהליכים תלויים אנזימטיים כגון הגברת RNA או הכנה של ספריות cDNA. עם זאת, בדיקות מותאמות בדרך כלל לתשומות בין 50-300 ננוגרם של סך ה-RNA25,26, אשר, בהתבסס על הממצאים של de Bruin et al.24, ייתכן שאינן תואמות לרקמות שעברו מיקרו-דיסקציה מבלי להגדיל את קלט הרקמה; דרישה שלילית בעידן שבו דגימות רקמה נאספות יותר ויותר כביופסיות קטנות ולא כריתה כירורגית. קלטי הרנ”א ששימשו לבדיקת DLBCL90 נעו בין 68.5-300 ננוגרם הן עבור הרקמות המקרו-דיסקרטיות והן עבור הרקמות שלא נותחו. התוצאות מראות כי מקרו-דיסקציה הביאה לשינויי קריאה ב-60% מהדגימות שנבדקו, וכי שינויים אלה נצפו ללא קשר לקלט הרנ”א של הדגימות המאקרו-דיסקטיות. עם זאת, הסתברות ה-COO לקלט הרנ”א הנמוך אכן חצתה את סף הקריאה להסתברות COO GCB/UNC, כאשר הסף הוא 0 עד 0.9 עד 1.0 עבור שיחות ABC20. תתי-הסוגים העיקריים של DLBCL COO הם GCB ו-ABC, המהווים 41% ו-44% מכלל מקרי ה-DLBCL, כאשר UNC מייצג קבוצת ביניים של השניים ו-ABC הואהאגרסיבי ביותר 20,27. לפיכך, בעוד ששינוי הקריאה של COO עם ניתוח מאקרו של מדגם C לא גרם לשינוי גלוי בתת-סוג COO מ-GCB ל-ABC, השינוי מ-GCB ל-UNC עשוי להצביע על מעבר למחלה אגרסיבית יותר. יתר על כן, מחקרים אחרונים מצביעים על כך שתת-הסוג UNC אינו רק תת-סוג ביניים וכי הוא עשוי להיות בעל תכונות ספציפיות לתת-סוג ספציפי לניצול טיפולי28. באופן דומה, ניתוח מאקרו של דגימות A ו-E לא גרם לשינויים גלויים בקריאות DHITsig מ-DH שלילי ל-DH חיובי, או להיפך. עם זאת, התנועות של דגימת GCB (מדגם A) מ-NEG ל-UNCLASS ומדגם ABC (דגימה E) מ-UNCLASS ל-NEG בעת חשיפת מאקרו מתאימות מבחינה ביולוגית, שכן טרנסלוקציות כפולות של פגיעה הכוללת BCL2 מדווחות כתופעת GCB19 בלבד. למרות שטרנסלוקציות מזוהות באופן מסורתי ובכל מקום על ידי FISH במסגרות קליניות, יש מומנטום הולך וגדל לזהות שיטה חלופית פחות מעורבת וגוזלת זמן לזיהוי שלהן. בדיקת DLBCL90 היא כלי חשוב הנותן מענה לצורך זה, כאשר הרציונל לשימוש בו מתחזק על ידי הממצא כי בדיקה זו מסוגלת לזהות טרנסלוקציות קריפטיות לבדיקות FISH המשמשות באבחון קליני29.
פרוטוקול המאקרו-דיסקציה שתואר לעיל מתווה שיטה פשוטה המאפשרת לחוקרים להגדיל את תכולת הגידול של דגימות רקמה שבדרך כלל היו נופלות מתחת לסף קריטריוני ההכללה המקובלים במחקר. הכללת מקרו-דיסקציה בתהליך עבודה של מחקר מאפשרת לחוקרים להציל רקמות צפופות גידולים בצורה גרועה מהדרה של מחקרים על ידי הגדלת תכולת הגידול שלהם. בתורו, זה מאפשר ביטחון מוגבר כי הרנ”א וכתוצאה מכך eluates RNA ו- DNA מייצגים את הגידול תחת חקירה גנומית. אף על פי שקיימות שיטות מדויקות יותר לניתוח רקמות, עבור גידולים שגדלים בצורה רחבה יותר, לא פולשנית, דמוית יריעה או מוצקה, סביר להניח שמקרי-דיסקציה מספיקה. התוצאות שהוצגו כאן מדגישות את החשיבות של טוהר הגידול במבחנים גנומיים ובמקרו-דיסקציה ככלי אמין להשגת מטרה זו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משאב דגימת איידס וסרטן במימון NIH (ACSR, UM1 CA181255-2) במימון NIH במסגרת תוכנית המדע הביופסימני שלה. הסרטון צולם ועריכת הפוסט-פרודקשן בוצעה על ידי מאיו קליניק שירותי מדיה.
Materials
| 200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
| Coplin pots | Various | x | |
| DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
| d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
| Forceps | Various | x | |
| Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Master kits | NanoString | various | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Microtubes | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
| nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
| Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
| Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
| Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).
- Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).
- Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), 0178706 (2017).
- Oh, E., et al. Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples. PLoS One. 10 (12), 0144162 (2015).
- Holley, T., et al. Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples. PLoS One. 7 (11), 50586 (2012).
- . TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data Available from: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers (2021)
- Javey, M., et al. Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment. Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).
- Kim, Y. W., et al. Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).
- Foti, C., et al. Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician. Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).
- Meuse, C. W., Barker, P. E. Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).
- Schmeller, J., et al. Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA. Pathology – Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).
- Prema, V., et al. Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, 623-630 (2020).
- Ennishi, D., et al. Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).
- Rosenwald, A., et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).
- Scott, D. W., et al. High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology. Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).
- Scott, D. W., et al. Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).
- Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).
- Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R. Tissue microdissection. Methods in Molecular Biology. 424, 433-448 (2008).
- Geiersbach, K., et al. Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors. Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).
- de Bruin, E. C., et al. Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles. BMC Genomics. 6, 142 (2005).
- Ramsower, C. A., et al. Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma. Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).
- Maguire, A., et al. Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature. International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).
- Rosenwald, A., Staudt, L. M. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma. 44, 41-47 (2003).
- Wright, G. W., et al. A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications. Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).
- Hilton, L. K., et al. The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH. Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).
