Tumorinhoud verbeteren door tumormacrodissectie

FFPE-weefsels zijn vaak heterogene mengsels van tumor- en niet-tumorweefsels. Hoogsensitieve genomische tests komen steeds vaker voor in zowel klinische als onderzoeksomgevingen, maar kunnen worden verward door de aanwezigheid van besmettend niet-tumorweefsel. Inderdaad, een minimaal tumorgehalte van 60% wordt vaak aanbevolen voor genomische studies. Percentage tumor kan worden bepaald door het gebied van weefsel bezet door het tumormateriaal of door het aandeel van tumorcellen in het weefsel. Hoewel tumor per gebied een veelgebruikte metriek is voor tumorzuiverheid, geeft het niet altijd een nauwkeurige beschrijving van het weefsel weer. Overweeg twee weefsels, beide met 1000 cellen, waarvan 500 tumorcellen. In weefsel A zijn de 500 niet-tumorcellen stromale cellen met vergelijkbare volumes als die van de tumorcel. In dit weefsel kan het percentage tumor als 50% worden beschouwd door zowel de cellulariteit als het gebied. In weefsel B zijn de 500 niet-tumorcellen vetcellen met volumes die 4x die van de tumorcel zijn. In dit weefsel is het percentage tumor nog steeds 50% door cellulariteit, maar 20% door oppervlakte. Een derde weefsel, weefsel C, bestaat uit 500 tumorcellen plus 400 vetcellen en 800 stromale cellen met volumes die respectievelijk 4x en 0,5x die van de tumorcellen zijn. Gegeven 100 vetcellen is gelijk aan het volume van 800 stromale cellen, het percentage tumor van weefsel C is 29% door cellulariteit (500/1700) maar nog steeds 20% per gebied. Weefsel D bestaat ook uit de tumor-, vet- en stromale cellen met volumeverhoudingen van 1x, 4x en 0,1x. Het aantal cellen is echter respectievelijk 400, 10 en 720. Het percentage tumor van weefsel D is dus 35% door cellulariteit (400/1130), maar 78% door oppervlakte. Deze voorbeelden zijn te simplistisch en weerspiegelen geen weefselsamenstellingen uit de echte wereld, maar geven duidelijk het belang van weefselsamenstelling en het verschil tussen tumorinhoud per gebied en per cellulariteit weer. Belangrijk is dat als het gaat om het verrijken van tumorinhoud voor downstream nucleïnezuurextractie, tumorcellulaliteit het belangrijkste kenmerk is vanwege het verhoogde verstorende potentieel van het extraheren van genomisch materiaal uit meer niet-tumorcellen dan tumorcellen. Dit onderstreept niet alleen de noodzaak om het tumorgehalte van weefsels te beoordelen in termen van procentuele cellulariteit, maar ook de noodzaak om ongewenst weefsel te verwijderen om mogelijke negatieve effecten van het niet-tumorweefsel te minimaliseren. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor weefselverrijking, met als belangrijkste macrodissectie en microdissectie.

Macrodissectie, de methode die in dit protocol wordt beschreven, is relatief snel, eenvoudig en vereist geen dure of gespecialiseerde apparatuur. Hoewel macrodissectie het tumorgehalte sterk kan verbeteren, is het belangrijk om te begrijpen dat het niet-tumormateriaal niet volledig elimineert. Het doel van macrodissectie is om het weefsel van belang voldoende te verrijken door de uitsluiting van ongewenst weefsel om de “ruis” afkomstig van ongewenst weefsel te verminderen, wat op zijn beurt het signaal van interesse van het weefsel van belang kan verbeteren. Macrodissectie gemedieerde tumorverrijking is dus een manier om de signaal-ruisverhouding te verbeteren om markers van belang beter te detecteren, met name tumorspecifieke moleculaire markers met een lage abundantie of slechte expressie. Macrodissectie heeft echter beperkingen vanwege het gebrek aan precisie dat wordt geboden door grove hulpmiddelen zoals scheermesjes en is gevoelig voor precisieproblemen die voortvloeien uit de lijndikte van de marker van de patholoog, evenals mogelijke fouten bij het traceren van de H &E-afbakeningen van de pathologen. Zoals hierboven vermeld, is het niet mogelijk om 100% tumorzuiverheid te bereiken vanwege de aanwezigheid van inherente en tumor-inducerende stromale elementen (d.w.z. bindweefsel, stromale fibroblasten, bloedvaten, goedaardige reactieve lymfocyten, macrofagen) ingebed in de tumor zelf. Inderdaad, veel invasieve of diffuus infiltratieve maligniteiten induceren een robuuste desmoplastische stromale respons, wat resulteert in clusters van tumorcellen die intiem worden vermengd met stromale fibroblasten en andere niet-neoplastische celtypen; waar tumoren geassocieerd met dit stromale reactiepatroon, zoals^{pancreaskankerweefsels 21}, meer baat kunnen hebben bij digitaal geleide microdissectie in plaats van handmatige macrodissectie.

Handmatige microdissectie wordt uitgevoerd onder een microscoop om identificatie, dissectie en isolatie van weefselspecifieke cellen of populaties te helpen met behulp van een naald of scalpel en heeft het voordeel van verhoogde precisie ten opzichte van macrodissectie²². Handmatige microdissectie is echter een moeizaam proces dat de finesse mist die nodig is voor complexe weefsels met een laag tumorgehalte of ingewikkelde kenmerken die niet compatibel zijn met handmatige dissectie. Dergelijke weefsels kunnen worden ontleed met behulp van zeer nauwkeurige geautomatiseerde methoden zoals laser capture microdissectie. Het is inderdaad aangetoond dat digitaal geleide microdissectie een hoger percentage tumorinhoud oplevert in vergelijking met handmatige macrodissectie in pancreaskankerweefsels²³. De nadelen van deze geautomatiseerde methoden met hoge precisie, zoals de behoefte aan gespecialiseerde, dure apparatuur en hoogopgeleide personen, hebben de integratie ervan in workflows echter belemmerd. Een studie van de Bruin et al. waarin de effecten van macrodissectie en laser capture microdissection (LCM) op genexpressieprofilering werden vergeleken, wees uit dat LCM-monsters lage totale RNA-opbrengsten hadden (30 ng gemiddeld) en twee rondes van mRNA-amplificatie nodig hadden om de cDNA-bibliotheekvoorbereidingsdrempel²⁴ te bereiken. De auteurs ontdekten dat de resulterende LCM-genexpressieprofielen meer werden beïnvloed door de rondes van mRNA-amplificatie dan macrodissected profielen werden beïnvloed door niet-tumorstromale bijdragen en concludeerden dat macrodissectie adequaat kon worden gebruikt om betrouwbare genexpressiegegevens te genereren²⁴.

Een belangrijk voordeel van NanoString digitale genexpressieprofilering, met name bij het werken met sterk afgebroken FFPE-afgeleid RNA, is dat het geen enzymatische afhankelijke processen vereist, zoals RNA-amplificatie of voorbereiding van cDNA-bibliotheken. Assays zijn echter meestal geoptimaliseerd voor inputs tussen 50-300 ng van totaal RNA^25,26, die, op basis van de bevindingen van de Bruin et ^al.24, mogelijk niet compatibel zijn met microdissected weefsels zonder de weefselinvoer te verhogen; een ongunstige vraag in een tijdperk waarin weefselmonsters steeds vaker worden verzameld als kleine biopsieën in plaats van chirurgische resecties. De RNA-inputs die werden gebruikt voor de DLBCL90-test varieerden van 68,5-300 ng voor zowel de macro-ontleedde als niet-ontlede weefsels. De resultaten tonen aan dat macrodissectie resulteerde in callveranderingen in 60% van de onderzochte monsters en dat deze veranderingen werden waargenomen ongeacht de RNA-input van de macrodissected monsters. De COO-waarschijnlijkheid voor de lage RNA-input heeft echter de COO GCB / UNC-waarschijnlijkheidsoproepdrempel overschreden, waarbij de drempels 0 tot 0,9 tot 1,0 voor ABC-oproepen²⁰. De belangrijkste DLBCL COO-subtypen zijn GCB en ABC, die 41% en 44% van alle DLBCL-gevallen uitmaken, waarbij UNC een tussengroep van de twee vertegenwoordigt en ABC de meest agressieve^20,27. Dus, terwijl de COO-oproepverandering bij macrodissectie van monster C geen duidelijke verandering in COO-subtype van GCB naar ABC veroorzaakte, kan de verandering van GCB naar UNC een verschuiving naar een agressievere ziekte suggereren. Bovendien geven recente studies aan dat het UNC-subtype niet alleen een tussenliggend subtype is en dat het mogelijk subtypespecifieke therapeutisch exploiteerbare eigenschappen kan bezitten²⁸. Evenzo veroorzaakte macrodissectie van monsters A en E geen duidelijke veranderingen in DHITsig-oproepen van DH-negatief naar DH-positief, of omgekeerd. De bewegingen van een GCB-monster (monster A) van NEG naar UNCLASS en een ABC-monster (monster E) van UNCLASS naar NEG bij macrodissectie zijn echter biologisch geschikt, aangezien double hit-translocaties met BCL2 naar verluidt een uitsluitend GCB-fenomeen zijn¹⁹. Hoewel translocaties traditioneel en alomtegenwoordig worden gedetecteerd door FISH in klinische omgevingen, is er een groeiend momentum om een alternatieve, minder betrokken en tijdrovende methode voor hun detectie te identificeren. De DLBCL90-test is een belangrijk hulpmiddel dat aan deze behoefte voldoet, waarbij de reden voor het gebruik ervan wordt versterkt door de bevinding dat deze test in staat is om translocaties te detecteren die cryptisch zijn voor FISH-sondes die worden gebruikt in klinische diagnostiek²⁹.

Het hierboven beschreven macrodissectieprotocol schetst een eenvoudige methode waarmee onderzoekers het tumorgehalte van weefselmonsters kunnen verhogen die normaal gesproken onder de gebruikelijke drempelwaarden voor studie-inclusiecriteria zouden vallen. Het opnemen van macrodissectie in een studieworkflow stelt onderzoekers in staat om slecht tumordichte weefsels te redden van studie-uitsluiting door hun tumorgehalte te verhogen. Dit zorgt op zijn beurt voor meer vertrouwen dat het resulterende RNA en DNA-eluaten de tumor vertegenwoordigen die genomisch wordt onderzocht. Hoewel er andere, meer precieze methoden voor weefseldissectie bestaan, is macrodissectie voor tumoren die op een meer expansieve, niet-infiltratieve, bladachtige of solide manier groeien, waarschijnlijk voldoende. De hier gepresenteerde resultaten benadrukken het belang van tumorzuiverheid in genomische assays en macrodissectie als een betrouwbaar hulpmiddel om dit te bereiken.