Amélioration du contenu tumoral grâce à la macrodissection tumorale

Les tissus FFPE sont souvent des mélanges hétérogènes de tissus tumoraux et non tumoraux. Les tests génomiques à haute sensibilité sont de plus en plus répandus dans les milieux cliniques et de recherche, mais peuvent être confondus par la présence de tissus non tumoraux contaminants. En effet, une teneur minimale en tumeur de 60% est fréquemment recommandée pour les études génomiques. Le pourcentage de tumeur peut être déterminé par la zone de tissu occupée par le matériau tumoral ou par la proportion de cellules tumorales dans le tissu. Bien que la tumeur par zone soit une mesure couramment utilisée pour la pureté tumorale, elle ne décrit pas toujours une description précise du tissu. Considérons deux tissus, tous deux avec 1000 cellules, dont 500 sont des cellules tumorales. Dans le tissu A, les 500 cellules non tumorales sont des cellules stromales avec des volumes similaires à ceux de la cellule tumorale. Dans ce tissu, le pourcentage de tumeur peut être considéré comme 50% à la fois par la cellularité et la zone. Dans le tissu B, les 500 cellules non tumorales sont des cellules graisseuses dont les volumes sont 4 fois supérieurs à ceux de la cellule tumorale. Dans ce tissu, le pourcentage de tumeur est encore de 50% par cellularité mais de 20% par surface. Un troisième tissu, le tissu C, est composé de 500 cellules tumorales plus 400 cellules graisseuses et 800 cellules stromales avec des volumes qui sont 4x et 0,5x celui des cellules tumorales, respectivement. Étant donné que 100 cellules graisseuses équivaut au volume de 800 cellules stromales, le pourcentage de tumeur du tissu C est de 29% par cellularité (500/1700) mais toujours de 20% par surface. Le tissu D est également composé de la tumeur, de la graisse et des cellules stromales avec des rapports de volume de 1x, 4x et 0,1x. Cependant, le nombre de cellules est de 400, 10 et 720, respectivement. Ainsi, le pourcentage de tumeur du tissu D est de 35% par cellularité (400/1130) mais de 78% par surface. Ces exemples sont trop simplistes et ne reflètent pas les compositions tissulaires du monde réel, mais transmettent clairement l’importance de la composition tissulaire et la différence entre le contenu tumoral par zone et par cellularité. Il est important de noter que lorsqu’il s’agit d’enrichir le contenu tumoral pour l’extraction des acides nucléiques en aval, la cellularité tumorale est l’attribut le plus important en raison du potentiel de confusion accru de l’extraction de matériel génomique à partir de plus de cellules non tumorales que de cellules tumorales. Cela souligne non seulement la nécessité d’évaluer le contenu tumoral des tissus en termes de pourcentage de cellularité, mais également la nécessité d’exciser les tissus indésirables afin de minimiser les effets négatifs potentiels du tissu non tumoral. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour l’enrichissement des tissus, les principales étant la macrodissection et la microdissection.

La macrodissection, la méthode décrite dans ce protocole, est relativement rapide, simple et ne nécessite pas d’équipement coûteux ou spécialisé. Bien que la macrodissection puisse grandement améliorer le contenu tumoral, il est important de comprendre qu’elle n’élimine pas complètement le matériel non tumoral. Le but de la macrodissection est d’enrichir suffisamment le tissu d’intérêt par l’exclusion des tissus indésirables afin de réduire le « bruit » provenant des tissus indésirables, ce qui peut à son tour renforcer le signal d’intérêt du tissu d’intérêt. Ainsi, l’enrichissement tumoral médié par macrodissection est un moyen d’améliorer le rapport signal/bruit afin de mieux détecter les marqueurs d’intérêt, en particulier les marqueurs moléculaires spécifiques à la tumeur avec une faible abondance ou une mauvaise expression. Cependant, la macrodissection a des limites en raison du manque de précision offert par les outils grossiers tels que les lames de rasoir et est sensible aux problèmes de précision découlant de l’épaisseur de ligne du marqueur du pathologiste, ainsi qu’aux erreurs potentielles lors du traçage des démarcations H & E des pathologistes. Comme mentionné ci-dessus, il n’est pas possible d’atteindre une pureté tumorale de 100% en raison de la présence d’éléments stromaux inhérents et induisant la tumeur (c’est-à-dire le tissu conjonctif, les fibroblastes stromaux, les vaisseaux sanguins, les lymphocytes réactifs bénins, les macrophages) intégrés dans la tumeur elle-même. En effet, de nombreuses tumeurs malignes invasives ou infiltrantes diffuses induisent une réponse stromale desmoplastique robuste, résultant en grappes de cellules tumorales qui sont intimement mélangées avec des fibroblastes stromaux et d’autres types de cellules non néoplasiques; où les tumeurs associées à ce schéma de réaction stromale, telles que les tissus cancéreux du pancréas²¹, peuvent bénéficier davantage d’une microdissection guidée numériquement que d’une macrodissection manuelle.

La microdissection manuelle est réalisée au microscope pour faciliter l’identification, la dissection et l’isolement de cellules ou de populations spécifiques de tissus à l’aide d’une aiguille ou d’un scalpel et présente l’avantage d’une précision accrue par rapport à la macrodissection²². Cependant, la microdissection manuelle est un processus laborieux qui manque de la finesse nécessaire pour les tissus complexes avec un faible contenu tumoral ou des caractéristiques complexes incompatibles avec la dissection manuelle. Ces tissus peuvent être disséqués à l’aide de méthodes automatisées de haute précision telles que la microdissection par capture laser. En effet, il a été démontré que la microdissection guidée numériquement donne un pourcentage plus élevé de contenu tumoral par rapport à la macrodissection manuelle dans les tissus cancéreux du pancréas²³. Cependant, les inconvénients de ces méthodes automatisées de haute précision, tels que le besoin d’équipements spécialisés et coûteux et de personnes hautement qualifiées, ont entravé son intégration dans les flux de travail. Une étude de de Bruin et al. comparant les effets de la macrodissection et de la microdissection par capture laser (LCM) sur le profilage de l’expression génique a révélé que les échantillons de LCM avaient de faibles rendements totaux en ARN (30 ng en moyenne) et nécessitaient deux cycles d’amplification de l’ARNm afin d’atteindre le seuil d’entrée de préparation de la bibliothèque d’ADNc²⁴. Les auteurs ont constaté que les profils d’expression génique LCM résultants étaient affectés par les cycles d’amplification de l’ARNm plus que les profils macrodisséqués étaient affectés par des contributions stromales non tumorales et ont conclu que la macrodissection pouvait être utilisée de manière adéquate pour générer des données fiables sur^{l’expression génique 24}.

Un avantage significatif du profilage de l’expression génique numérique NanoString, en particulier lorsque vous travaillez avec de l’ARN dérivé de FFPE fortement dégradé, est qu’il ne nécessite pas de processus dépendants enzymatiques tels que l’amplification de l’ARN ou la préparation de bibliothèques d’ADNc. Cependant, les essais sont généralement optimisés pour les entrées comprises entre 50 et 300 ng de l’ARN^{total 25,26}, ce qui, d’après les résultats de de Bruin et ^al.24, peut ne pas être compatible avec les tissus microdisséqués sans augmenter l’apport tissulaire; une demande défavorable à une époque où les échantillons de tissus sont de plus en plus prélevés sous forme de petites biopsies plutôt que de résections chirurgicales. Les entrées d’ARN utilisées pour le test DLBCL90 variaient de 68,5 à 300 ng pour les tissus macrodisséqués et non disséqués. Les résultats montrent que la macrodissection a entraîné des changements d’appel dans 60% des échantillons examinés et que ces changements ont été observés indépendamment de l’entrée d’ARN des échantillons macrodisséqués. Cependant, la probabilité COO pour l’entrée d’ARN faible a empiété sur le seuil d’appel de probabilité COO GCB/UNC, où les seuils sont de 0 à 0,9 à 1,0 pour les appels ABC²⁰. Les principaux sous-types de COO DLBCL sont GCB et ABC, qui représentent 41% et 44% de tous les cas de DLBCL, l’UNC représentant un groupe intermédiaire des deux et ABC étant le^{plus agressif 20,27}. Ainsi, bien que le changement d’appel du chef de l’exploitation lors de la macrodissection de l’échantillon C n’ait pas entraîné un changement franc du sous-type de chef de l’exploitation de GCB à ABC, le changement de GCB à UNC peut suggérer un changement vers une maladie plus agressive. De plus, des études récentes indiquent que le sous-type UNC n’est pas simplement un sous-type intermédiaire et qu’il peut potentiellement posséder des attributs thérapeutiques exploitables spécifiques au sous-type²⁸. De même, la macrodissection des échantillons A et E n’a pas provoqué de changements francs dans les appels DHITsig de DH négatif à DH positif, ou vice versa. Cependant, les mouvements d’un échantillon GCB (échantillon A) de NEG à UNCLASS et d’un échantillon ABC (échantillon E) de UNCLASS à NEG lors de la macrodissection sont biologiquement appropriés car les translocations à double succès impliquant BCL2 sont signalées comme étant un phénomène exclusivement GCB¹⁹. Bien que les translocations soient traditionnellement et omniprésentes détectées par FISH en milieu clinique, il existe un élan croissant pour identifier une méthode alternative moins impliquée et plus longue pour leur détection. Le test DLBCL90 est un outil important qui répond à ce besoin, où la justification de son utilisation est renforcée par la découverte que ce test est capable de détecter des translocations cryptiques aux sondes FISH utilisées dans les diagnostics cliniques²⁹.

Le protocole de macrodissection décrit ci-dessus décrit une méthode simple qui permet aux chercheurs d’augmenter la teneur en tumeurs d’échantillons de tissus qui tomberaient normalement en dessous des seuils d’inclusion d’études couramment utilisés. L’inclusion de la macrodissection dans un flux de travail d’étude permet aux chercheurs de sauver des tissus peu denses en tumeurs de l’exclusion de l’étude en augmentant leur contenu tumoral. À son tour, cela permet une confiance accrue dans le fait que l’ARN et l’ADN résultants représentent la tumeur faisant l’objet d’une enquête génomique. Bien qu’il existe d’autres méthodes plus précises de dissection tissulaire, pour les tumeurs qui se développent de manière plus expansive, non infiltrante, en forme de feuille ou solide, la macrodissection est probablement suffisante. Les résultats présentés ici soulignent l’importance de la pureté tumorale dans les tests génomiques et la macrodissection en tant qu’outil fiable pour y parvenir.