Verbesserung des Tumorgehalts durch Tumormakrodissektion

FFPE-Gewebe sind häufig heterogene Beimischungen von Tumor- und Nicht-Tumorgeweben. Hochempfindliche genomische Tests werden sowohl in klinischen als auch in Forschungsumgebungen immer häufiger, können jedoch durch das Vorhandensein von kontaminierendem Nicht-Tumorgewebe verwirrt werden. Tatsächlich wird für genomische Studien häufig ein Mindesttumorgehalt von 60% empfohlen. Der prozentuale Tumor kann durch die Gewebefläche, die vom Tumormaterial besetzt ist, oder durch den Anteil der Tumorzellen innerhalb des Gewebes bestimmt werden. Obwohl Tumor nach Fläche eine häufig verwendete Metrik für die Tumorreinheit ist, zeigt sie nicht immer eine genaue Beschreibung des Gewebes. Betrachten Sie zwei Gewebe, beide mit 1000 Zellen, von denen 500 Tumorzellen sind. Im Gewebe A sind die 500 Nicht-Tumorzellen Stromazellen mit ähnlichen Volumina wie die Tumorzelle. In diesem Gewebe kann der Prozentsatz des Tumors sowohl nach Zellularität als auch nach Fläche als 50% angesehen werden. Im Gewebe B sind die 500 Nicht-Tumorzellen Fettzellen mit Volumina, die 4x so groß sind wie die der Tumorzelle. In diesem Gewebe beträgt der prozentuale Tumor immer noch 50% nach Zellularität, aber 20% nach Fläche. Ein drittes Gewebe, Gewebe C, besteht aus 500 Tumorzellen plus 400 Fettzellen und 800 Stromazellen mit Volumina, die 4x bzw. 0,5x so groß sind wie das der Tumorzellen. Bei 100 Fettzellen, die dem Volumen von 800 Stromazellen entsprechen, beträgt der prozentuale Tumor des Gewebes C 29% nach Zellularität (500/1700), aber immer noch 20% nach Fläche. Gewebe D besteht auch aus Tumor-, Fett- und Stromazellen mit Volumenverhältnissen von 1x, 4x und 0,1x. Die Anzahl der Zellen beträgt jedoch 400, 10 bzw. 720. Somit beträgt der prozentuale Tumor von Gewebe D 35% nach Zellularität (400/1130), aber 78% nach Fläche. Diese Beispiele sind zu einfach und spiegeln keine realen Gewebezusammensetzungen wider, sondern vermitteln deutlich die Bedeutung der Gewebezusammensetzung und den Unterschied zwischen Tumorgehalt nach Fläche und Zellularität. Wenn es um die Anreicherung des Tumorgehalts für die nachgeschaltete Nukleinsäureextraktion geht, ist die Tumorzellularität aufgrund des erhöhten Störpotenzials der Extraktion von genomischem Material aus mehr Nicht-Tumorzellen als Tumorzellen das wichtigere Attribut. Dies unterstreicht nicht nur die Notwendigkeit, den Tumorgehalt von Geweben in Bezug auf die prozentuale Zellularität zu bewerten, sondern auch die Notwendigkeit, unerwünschtes Gewebe zu entfernen, um mögliche negative Auswirkungen des Nicht-Tumorgewebes zu minimieren. Es gibt mehrere Methoden zur Gewebeanreicherung, wobei die wichtigsten Makrodissektion und Mikrodissektion sind.

Die Makrodissektion, die in diesem Protokoll beschriebene Methode, ist relativ schnell, einfach und erfordert keine kostspielige oder spezielle Ausrüstung. Obwohl die Makrodissektion den Tumorgehalt stark verbessern kann, ist es wichtig zu verstehen, dass sie Nicht-Tumormaterial nicht vollständig eliminiert. Der Zweck der Makrodissektion besteht darin, das interessierende Gewebe durch den Ausschluss von unerwünschtem Gewebe ausreichend anzureichern, um das von unerwünschtem Gewebe ausgehende “Rauschen” zu reduzieren, was wiederum das Signal des Interesses des interessierenden Gewebes verstärken kann. Daher ist die makrodissektionsvermittelte Tumoranreicherung eine Möglichkeit, das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, um Marker von Interesse besser zu erkennen, insbesondere tumorspezifische molekulare Marker mit geringer Häufigkeit oder schlechter Expression. Die Makrodissektion hat jedoch Einschränkungen aufgrund der mangelnden Präzision, die grobe Werkzeuge wie Rasierklingen bieten, und ist anfällig für Präzisionsprobleme, die sich aus der Linienstärke des Markers des Pathologen ergeben, sowie für mögliche Fehler bei der Verfolgung der H & E-Abgrenzungen der Pathologen. Wie oben angedeutet, ist es nicht möglich, eine 100%ige Tumorreinheit zu erreichen, da inhärente und tumorinduzierende Stromaelemente (dh Bindegewebe, Stromafibroblasten, Blutgefäße, gutartige reaktive Lymphozyten, Makrophagen), die in den Tumor selbst eingebettet sind, vorhanden sind. Tatsächlich induzieren viele invasive oder diffus infiltrative Malignome eine robuste desmoplastische Stromareaktion, was zu Clustern von Tumorzellen führt, die eng mit stromalen Fibroblasten und anderen nicht-neoplastischen Zelltypen vermischt sind; wo Tumore, die mit diesem stromalen Reaktionsmuster assoziiert sind, wie Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe²¹, mehr von digital geführter Mikrodissektion als von manueller Makrodissektion profitieren können.

Die manuelle Mikrodissektion wird unter einem Mikroskop durchgeführt, um die Identifizierung, Dissektion und Isolierung von gewebespezifischen Zellen oder Populationen mit einer Nadel oder einem Skalpell zu unterstützen, und hat den Vorteil einer erhöhten Präzision gegenüber der Makrodissektion²². Die manuelle Mikrodissektion ist jedoch ein mühsamer Prozess, dem die für komplexe Gewebe mit niedrigem Tumorgehalt oder komplizierten Merkmalen, die mit der manuellen Dissektion nicht kompatibel sind, erforderliche Finesse fehlt. Solche Gewebe können mit hochpräzisen automatisierten Methoden wie der Laser-Capture-Mikrodissektion seziert werden. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die digital geführte Mikrodissektion im Vergleich zur manuellen Makrodissektion in Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe einen höheren prozentualen Tumorgehalt liefert²³. Die Nachteile dieser hochpräzisen automatisierten Methoden, wie der Bedarf an spezialisierten, teuren Geräten und gut ausgebildeten Personen, haben jedoch die Integration in Arbeitsabläufe behindert. Eine Studie von de Bruin et al., in der die Auswirkungen von Makrodissektion und Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) auf die Genexpressionsprofilierung verglichen wurden, ergab, dass LCM-Proben niedrige Gesamt-RNA-Ausbeuten (30 ng-Durchschnitt) aufwiesen und zwei Runden mRNA-Amplifikation erforderten, um die cDNA-Bibliotheksvorbereitungs-Eingangsschwelle²⁴ zu erreichen. Die Autoren fanden heraus, dass die resultierenden LCM-Genexpressionsprofile von den Runden der mRNA-Amplifikation stärker beeinflusst wurden als makrodissektierte Profile von Nicht-Tumorstroma-Beiträgen betroffen waren, und folgerten, dass die Makrodissektion angemessen genutzt werden könnte, um zuverlässige Genexpressionsdaten^{zu generieren 24}.

Ein wesentlicher Vorteil der digitalen Genexpressionsprofilierung von NanoString, insbesondere bei der Arbeit mit hochgradig abgebauter FFPE-abgeleiteter RNA, besteht darin, dass keine enzymatisch abhängigen Prozesse wie RNA-Amplifikation oder Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken erforderlich sind. Assays sind jedoch typischerweise für Inputs zwischen 50-300 ng der Gesamt-RNA 25,26 optimiert, die auf der Grundlage der Ergebnisse von de Bruin et ^al.24 möglicherweise nicht mit mikrodissektiertem Gewebe kompatibel sind, ohne den Gewebeeintrag zu erhöhen; Eine ungünstige Nachfrage in einer Zeit, in der Gewebeproben zunehmend als kleine Biopsien und nicht als chirurgische Resektionen gesammelt werden. Die für den DLBCL90-Assay verwendeten RNA-Inputs reichten von 68,5 bis 300 ng sowohl für das makrodissektierte als auch für das nicht dissektierte Gewebe. Die Ergebnisse zeigen, dass die Makrodissektion bei 60% der untersuchten Proben zu Aufrufänderungen führte und dass diese Veränderungen unabhängig vom RNA-Input der makrodissektierten Proben beobachtet wurden. Die COO-Wahrscheinlichkeit für den niedrigen RNA-Eingang hat jedoch die COO GCB/UNC-Wahrscheinlichkeitsschwelle überschritten, wo die Schwellenwerte 0 bis 0,9 bis 1,0 für ABC-Anrufe²⁰ sind. Die wichtigsten DLBCL-COO-Subtypen sind GCB und ABC, die 41% und 44% aller DLBCL-Fälle ausmachen, wobei UNC eine Zwischengruppe der beiden und ABC die aggressivsten^20,27 darstellt. Während also die Änderung des COO-Aufrufs bei der Makrodissektion von Stichprobe C keine offene Änderung des COO-Subtyps von GCB zu ABC verursachte, kann der Wechsel von GCB zu UNC auf eine Verschiebung hin zu einer aggressiveren Krankheit hindeuten. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass der UNC-Subtyp nicht einfach nur ein Zwischensubtyp ist und dass er potenziell subtypspezifische therapeutisch nutzbare Eigenschaften besitzen^{kann 28}. In ähnlicher Weise verursachte die Makrodissektion der Proben A und E keine offenen Änderungen der DHITsig-Aufrufe von DH negativ zu DH positiv oder umgekehrt. Die Bewegungen einer GCB-Probe (Probe A) von NEG nach UNCLASS und einer ABC-Probe (Probe E) von UNCLASS zu NEG bei Makrodissektion sind jedoch biologisch angemessen, da berichtet wird, dass Doppelschlagtranslokationen mit BCL2 ausschließlich ein GCB-Phänomen^{sind 19}. Obwohl Translokationen traditionell und allgegenwärtig von FISH in klinischen Umgebungen nachgewiesen werden, gibt es eine wachsende Dynamik, eine alternative, weniger komplizierte und zeitaufwändige Methode für ihre Erkennung zu identifizieren. Der DLBCL90-Assay ist ein wichtiges Instrument, das diesem Bedarf gerecht wird, wobei die Begründung für seine Verwendung durch die Feststellung gestärkt wird, dass dieser Assay in der Lage ist, kryptische Translokationen zu FISH-Sonden zu erkennen, die in der klinischen Diagnostik verwendet werden²⁹.

Das oben beschriebene Makrodissektionsprotokoll skizziert eine einfache Methode, die es Forschern ermöglicht, den Tumorgehalt von Gewebeproben zu erhöhen, die normalerweise unter die üblicherweise verwendeten Grenzwerte für Studieneinschlusskriterien fallen würden. Die Einbeziehung der Makrodissektion in einen Studien-Workflow ermöglicht es Forschern, schlecht tumordichtes Gewebe aus dem Studienausschluss zu retten, indem sie ihren Tumorgehalt erhöhen. Dies wiederum ermöglicht ein erhöhtes Vertrauen, dass die resultierenden RNA- und DNA-Eluate den Tumor darstellen, der genomisch untersucht wird. Obwohl es andere präzisere Methoden für die Gewebedissektion gibt, ist die Makrodissektion für Tumore, die expansivere, nicht infiltrative, blattartiger oder fester wachsen, wahrscheinlich ausreichend. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Tumorreinheit in genomischen Assays und der Makrodissektion als zuverlässiges Werkzeug, um dies zu erreichen.