腫瘍マクロ解剖による腫瘍含量の増加

合計5つのびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)FFPE組織ブロックを切片化し、得られた切片を核酸抽出の前にマクロ解剖するか、または切除しなかった。抽出したRNAをDLBCL90アッセイ16上で実行した。大切開サンプルを2回実行し、1回は5 μLのRNAストック濃度を使用し、1回は総RNAインプットの300 ng以下を使用し、1回は5 μLのRNAストックを使用して、それぞれの解剖されていない対応物のRNAインプットと一致するように希釈しました。DLBCL90の結果の概要を 表2に示します。 DLBCLは、異なる治療応答性を有する3つの異なる起源細胞(COO)サブタイプ、すなわちGCB、ABC、および未分類またはUNC17,18として知られる中間群からなる。MYC、BCL2、およびBCL6を単独または組み合わせて関与する転座(ダブルまたはトリプルヒット)もまた、DLBCL、特にGCBサブタイプ19において頻繁に観察される。DLBCL90アッセイは、その前身であるLymph2Cx臨床アッセイの拡張であり、DLBCL COOサブタイプ決定が可能ですが、主に蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)の代替としてデジタル遺伝子発現を使用してBCL2を含むダブルヒット(DH)転座を有するサンプルを同定するために開発されました16,20。表2の結果は、マクロ解剖が、調査したサンプルの60%(3/5)のCOOまたはDHITsigステータスコールのいずれかを変化させたことを示しています。 サンプルAのマクロ解剖はCOOコールには影響しなかったが、DHITsigコールをNEGからUNCLASSに変更し、この変化はマクロ解剖されたサンプルRNA入力に関係なく、同様の確率スコア(0.224、0.254)で観察された。対照的に、サンプルCのマクロ解剖はDHITsigコールには影響を及ぼさなかったが、COOコールをGCBからUNCに変更した。ここでも、この変化は、大解剖されたサンプルRNA入力に関係なく観察された。しかし、0.117では、COOコール確率は、RNAインプットが減少したマクロ解剖サンプルのコール閾値0.1に近かった。サンプル A と同様に、サンプル E のマクロ解剖は COO 呼び出しには影響しませんでしたが、DHITsig 呼び出しを変更しました。しかし、サンプルEの場合、コールはUNCLASSからNEGに変更され、合理的に類似した確率コール(0.849、0.833)でマクロ解剖されたサンプルRNA入力に関係なくそうしました。特に、DHITsig NEGへのこのコール変化は、サンプルEがABC-DLBCLに見出され、BCL2を含む二重ヒット転座がGCB-DLBCLで排他的に観察されることが報告されていることを考えると、生物学的に理にかなっている19。 図1:ミクロトームを用いたスライドマウント 組織切片の生成(A)FFPE組織ブロックをミクロトームチャックで所定の位置に保持し、切断して、順次FFPE組織切片のリボンを作製した。(B)予め浸した木の棒を用いて、ミクロトームからリボンを回収し、温水浴に移す。(C)水の暖かさは、組織リボンのしわをアイロンをかけるのに役立ちます。(D)個々のFFPE組織切片は、2つの切片の接合部に閉じた鉗子を配置し、鉗子を静かに開いて、切片を互いに切断することによって、組織リボンから除去される。(E)切片は、スライドガラスを斜めに沈め、切片の端がスライドガラスに触れるまで組織切片に向かって側面を静かに移動させることによって、水から収集される。(F)スライドとセクションが接触したら、ゆっくりとスライドを水から取り外し、組織セクションがスライドに対して平らになるようにします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色切片の病理学および組織学的レビュー(A,B)H&E組織切片は、ボード認定病理学者による顕微鏡レビューを受ける。(C,D)病理学者が組織全体を見て、それが100%腫瘍組織ではないことを発見したら、病理学者はマーカーを使用して組織の腫瘍領域を囲む。(E,F)マークされたH&Eを元のFFPE組織ブロックに対して保持することは、すべての組織が腫瘍材料ではないことを示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:組織サンプル この画像は、病理学的にレビューされ、腫瘍マークが付いたH&E(行1)、未処理のスライドマウントFFPE組織切片(行2)、脱パラフィン化スライドマウントFFPE組織切片(行3)、スライドの背面に病理マーキングがトレースされた脱パラフィン化スライドマウントFFPE組織切片(行4)、このプロトコルを実証するために使用された5サンプル(A-E)の脱パラフィン化およびマクロ解剖されたスライドマウントFFPE組織切片(行5)を実証する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:FFPE組織切片の脱パラフィン化およびマクロ解剖:(A)ヒュームフード内で、スライドラックに取り付けられたFFPE組織は、2回のd-リモネン洗浄と1回のエタノール洗浄で洗浄される。(B,C)洗浄後、すべてのパラフィンが除去され、組織のみがスライド上に残り、これは現在、洗浄前のものと比較して白く、非常に視認性が高い。(D)脱パラフィン化スライドに取り付けられた組織切片は、その一致するマーク付きH&Eの背面にうつ伏せに置かれる(E)H&Eの腫瘍領域マーキングは、微細または超微細なニブ付き永久マーカーを使用して脱パラフィン化スライドの背面にトレースされる(F)マークされた脱パラフィン化スライドマウント組織切片は、次いで、グリセロール洗浄に浸漬され、収集のために組織切片を湿らせる。スライドをグリセロールからゆっくりと除去し、スライドの背面をティッシュで拭き取って余分なグリセロールを除去してから、スライド組織をベンチ上に上向きに敷く。(G)清潔なカミソリの刃の平らな側面を使用して、組織を大解剖し、病理学者のマーキングの外側の不要な組織を廃棄してから、刃の端に沿って集まる目的の組織を収集する。(H)刃の端から採取した組織を除去するために木の棒を使用する。(i)次いで、組織は、予め標識されたマイクロチューブに予め充填された組織消化緩衝液に移され、核酸抽出の準備ができている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 サンプル ID 全組織(a) 組織の丸みを帯びた領域(b) 組織全体の腫瘍全体の含有量(c) マクロ解剖による腫瘍含量のフォールド増加(d) マクロ解剖されていない(e) マクロ解剖 (f) % 生存腫瘍 % その他 % 生存腫瘍 % その他 抽出された5μmスライドの数 RNA conc (ng/μL) 抽出された5μmスライドの数 RNAコンク(ng/μL) サンプルA 60 40 75 25 45 1.7 2 19.0 4 58.3 サンプルB 60 40 65 35 39 1.7 1 34.0 2 60.0 サンプル C 40 60 65 35 26 2.5 1 13.7 2 46.2 サンプル D 35 65 90 10 32 2.9 1 57.3 2 60.0 サンプル E 20 80 30 70 6 5.0 3 25.2 3 44.6 表1:病理レビューデータ。 表は、(a)領域別組織切片全体における生存腫瘍の割合、(b)細胞性によるレビュー中に病理学者が丸で囲んだ/マークした領域における生存腫瘍の割合、(c)組織全体の推定腫瘍細胞性(a x b)、(d)マクロ解剖で達成された腫瘍細胞性の推定倍数の増加、 (eおよびf)多数の5μmの染色されていないFFPEスライドマウント組織切片を抽出し、得られたRNA濃度を一致させた非マクロ解剖およびマクロ解剖サンプルについて抽出した。%その他は、所与の試料中に存在する、腫瘍組織ではない他のすべての組織を指し、結合組織、間質線維芽細胞、血管、ならびに他の固有の間質要素を含むことができる。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 サンプル ID RNA インプット (ng) DLBCL90 COO コール DLBCL90 呼び出し確率 DHITsig call DHITsig pos probability DHITsig neg 確率 マクロ解剖されていない サンプルA 95.0 ティッカー 0.000 ネグ 0.135 0.865 サンプルB 170.0 ティッカー 0.000 ネグ 0.032 0.968 サンプル C 68.5 ティッカー 0.028 ネグ 0.033 0.967 サンプル D 286.5 甲乙丙 0.998 ネグ 0.002 0.998 サンプル E 126.0 甲乙丙 0.989 アンクラス 0.212 0.788 マクロ解剖 サンプルA_M 291.7 ティッカー 0.000 アンクラス 0.224 0.776 サンプルB_M 300.0 ティッカー 0.000 ネグ 0.016 0.984 サンプルC_M 231.2 アンクラス 0.210 ネグ 0.015 0.985 サンプルD_M 300.0 甲乙丙 0.999 ネグ 0.002 0.998 サンプルE_M 223.2 甲乙丙 0.987 ネグ 0.151 0.849 マクロ解剖 & RNA 希釈 サンプルA_M 95.0 ティッカー 0.000 アンクラス 0.254 0.746 サンプルB_M 170.0 ティッカー 0.000 ネグ 0.023 0.977 サンプルC_M 68.5 アンクラス 0.117 ネグ 0.027 0.973 サンプルD_M 286.5 甲乙丙 0.999 ネグ 0.002 0.998 サンプルE_M 126.0 甲乙丙 0.995 ネグ 0.167 0.833 表2:DLBCL90デジタル遺伝子発現アッセイの結果。 5つのサンプル(A〜E)は、核酸抽出が行われる前にマクロ解剖されていないか、またはマクロ解剖された。得られたRNAをDLBCL90アッセイで実行し、最大RNAインプット量は5 μLであり、非マクロ解剖サンプルは5 μLのストックRNAを使用して実行した。マクロ解剖された各サンプルは、(a)60ng/μLのアリコートが可能でない限り、5μLのストックRNAを使用し、(b)5μLのストックRNAを使用して、マクロ解剖されていない対応物の濃度/入力に合わせて希釈した。接尾辞 _M は、そのサンプルがマクロ解剖されたことを示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。