Migliorare il contenuto tumorale attraverso la macrodissezione tumorale

I tessuti FFPE sono spesso mescolanze eterogenee di tessuti tumorali e non tumorali. I test genomici ad alta sensibilità stanno diventando sempre più diffusi sia in ambito clinico che di ricerca, ma possono essere confusi dalla presenza di tessuto non tumorale contaminante. Infatti, un contenuto minimo di tumore del 60% è spesso raccomandato per gli studi genomici. La percentuale di tumore può essere determinata dall’area di tessuto occupata dal materiale tumorale o dalla proporzione di cellule tumorali all’interno del tessuto. Sebbene il tumore per area sia una metrica comunemente usata per la purezza del tumore, non sempre ritrae una descrizione accurata del tessuto. Consideriamo due tessuti, entrambi con 1000 cellule, di cui 500 sono cellule tumorali. Nel tessuto A, le 500 cellule non tumorali sono cellule stromali con volumi simili a quelli della cellula tumorale. In questo tessuto, la percentuale di tumore può essere considerata del 50% sia dalla cellularità che dall’area. Nel tessuto B, le 500 cellule non tumorali sono cellule adipose con volumi 4 volte superiori a quelli della cellula tumorale. In questo tessuto, la percentuale di tumore è ancora del 50% per cellularità ma del 20% per area. Un terzo tessuto, il tessuto C, è composto da 500 cellule tumorali più 400 cellule adipose e 800 cellule stromali con volumi che sono rispettivamente 4x e 0,5x quello delle cellule tumorali. Dato che 100 cellule adipose equivalgono al volume di 800 cellule stromali, la percentuale di tumore del tessuto C è del 29% per cellularità (500/1700) ma ancora del 20% per area. Il tessuto D è anche composto da cellule tumorali, adipose e stromali con rapporti di volume di 1x, 4x e 0,1x. Tuttavia, il numero di celle è rispettivamente 400, 10 e 720. Pertanto, la percentuale di tumore del tessuto D è del 35% per cellularità (400/1130) ma del 78% per area. Questi esempi sono eccessivamente semplicistici e non riflettono le composizioni tissutali del mondo reale, ma trasmettono chiaramente l’importanza della composizione tissutale e la differenza tra il contenuto tumorale per area e per cellularità. È importante sottolineare che, quando si tratta di arricchire il contenuto tumorale per l’estrazione di acidi nucleici a valle, la cellularità tumorale è l’attributo più importante a causa dell’accresciuto potenziale confondente dell’estrazione di materiale genomico da più cellule non tumorali rispetto alle cellule tumorali. Ciò sottolinea non solo la necessità di valutare il contenuto tumorale dei tessuti in termini di percentuale di cellularità, ma anche la necessità di asportare il tessuto indesiderato al fine di ridurre al minimo eventuali potenziali effetti negativi del tessuto non tumorale. Esistono diversi metodi disponibili per l’arricchimento dei tessuti, i principali dei quali sono la macrodissezione e la microdissezione.

La macrodissezione, il metodo descritto in questo protocollo, è relativamente veloce, semplice e non richiede attrezzature costose o specializzate. Sebbene la macrodissezione possa migliorare notevolmente il contenuto tumorale, è importante capire che non elimina completamente il materiale non tumorale. Lo scopo della macrodissezione è quello di arricchire sufficientemente il tessuto di interesse attraverso l’esclusione di tessuti indesiderati al fine di ridurre il “rumore” derivante da tessuto indesiderato, che a sua volta può potenziare il segnale di interesse dal tessuto di interesse. Pertanto, l’arricchimento tumorale mediato dalla macrodissezione è un modo per migliorare il rapporto segnale-rumore al fine di rilevare meglio i marcatori di interesse, in particolare i marcatori molecolari specifici del tumore con bassa abbondanza o scarsa espressione. Tuttavia, la macrodissezione ha dei limiti a causa della mancanza di precisione offerta da strumenti grossolani come le lame di rasoio ed è suscettibile di problemi di precisione derivanti dallo spessore della linea del marcatore del patologo, nonché potenziali errori nel tracciare le demarcazioni H&E dei patologi. Come accennato in precedenza, non è possibile raggiungere il 100% di purezza tumorale a causa della presenza di elementi stromali intrinseci e che inducono il tumore (cioè tessuto connettivo, fibroblasti stromali, vasi sanguigni, linfociti reattivi benigni, macrofagi) incorporati all’interno del tumore stesso. Infatti, molte neoplasie invasive o diffusamente infiltrative inducono una robusta risposta stromale desmoplastica, con conseguente aggregazione di cellule tumorali intimamente mescolate con fibroblasti stromali e altri tipi di cellule non neoplastiche; dove i tumori associati a questo modello di reazione stromale, come i tessuti tumorali pancreatici²¹, possono beneficiare maggiormente della microdissezione guidata digitalmente piuttosto che della macrodissezione manuale.

La microdissezione manuale viene eseguita al microscopio per facilitare l’identificazione, la dissezione e l’isolamento di cellule o popolazioni specifiche dei tessuti utilizzando un ago o un bisturi e ha il vantaggio di una maggiore precisione rispetto alla macrodissezione²². Tuttavia, la microdissezione manuale è un processo laborioso che manca della finezza necessaria per tessuti complessi con basso contenuto tumorale o caratteristiche intricate che sono incompatibili con la dissezione manuale. Tali tessuti possono essere sezionati utilizzando metodi automatizzati ad alta precisione come la microdissezione a cattura laser. In effetti, la microdissezione guidata digitalmente ha dimostrato di produrre contenuti tumorali percentuali più elevati rispetto alla macrodissezione manuale nei tessuti tumorali pancreatici²³. Tuttavia, gli svantaggi di questi metodi automatizzati ad alta precisione, come la necessità di attrezzature specializzate e costose e di individui altamente qualificati, hanno ostacolato la sua incorporazione nei flussi di lavoro. Uno studio di de Bruin et al. che ha confrontato gli effetti della macrodissezione e della microdissezione a cattura laser (LCM) sul profilo di espressione genica ha rilevato che i campioni di LCM avevano bassi rendimenti totali di RNA (media 30 ng) e richiedevano due cicli di amplificazione dell’mRNA per soddisfare la soglia di input di preparazione della libreria cDNA²⁴. Gli autori hanno scoperto che i profili di espressione genica LCM risultanti erano influenzati dai cicli di amplificazione dell’mRNA più che dai profili macrodissezionati influenzati da contributi stromali non tumorali e hanno concluso che la macrodissezione potrebbe essere adeguatamente utilizzata per generare dati affidabili sull’espressione genica²⁴.

Un vantaggio significativo del profilo di espressione genica digitale NanoString, in particolare quando si lavora con RNA derivato da FFPE altamente degradato, è che non richiede processi enzimatici dipendenti come l’amplificazione dell’RNA o la preparazione di librerie di cDNA. Tuttavia, i saggi sono tipicamente ottimizzati per input tra 50-300 ng di RNA totale^25,26, che, sulla base dei risultati di de Bruin et ^al.24, potrebbero non essere compatibili con i tessuti microdissecati senza aumentare l’input tissutale; una domanda sfavorevole in un’epoca in cui i campioni di tessuto sono sempre più raccolti come piccole biopsie piuttosto che resezioni chirurgiche. Gli input di RNA utilizzati per il test DLBCL90 variavano da 68,5-300 ng sia per i tessuti macrosezionati che per quelli non sezionati. I risultati mostrano che la macrodissezione ha provocato cambiamenti di chiamata nel 60% dei campioni esaminati e che questi cambiamenti sono stati osservati indipendentemente dall’input di RNA dei campioni macrodissezionati. Tuttavia, la probabilità COO per l’input di RNA basso ha invaso la soglia di chiamata di probabilità COO GCB / UNC, dove le soglie sono da 0 a 0,9 a 1,0 per le chiamate ABC²⁰. I principali sottotipi di COO DLBCL sono GCB e ABC, che costituiscono il 41% e il 44% di tutti i casi di DLBCL, con UNC che rappresenta un gruppo intermedio dei due e ABC che è il più aggressivo^20,27. Pertanto, mentre il cambiamento della chiamata COO alla macrodissezione del campione C non ha causato un cambiamento franco nel sottotipo coO da GCB ad ABC, il cambiamento da GCB a UNC può suggerire uno spostamento verso una malattia più aggressiva. Inoltre, studi recenti indicano che il sottotipo UNC non è semplicemente un sottotipo intermedio e che può potenzialmente possedere attributi terapeuticamente sfruttabili specifici del sottotipo²⁸. Allo stesso modo, la macrodissezione dei campioni A ed E non ha causato cambiamenti franchi nelle chiamate DHITsig da DH negativo a DH positivo, o viceversa. Tuttavia, i movimenti di un campione GCB (campione A) da NEG a UNCLASS e di un campione ABC (campione E) da UNCLASS a NEG dopo macrodissezione sono biologicamente appropriati in quanto le traslocazioni a doppio colpo che coinvolgono BCL2 sono segnalate come un fenomeno esclusivamente GCB¹⁹. Sebbene le traslocazioni siano tradizionalmente e ubiquitariamente rilevate da FISH in contesti clinici, c’è un crescente slancio per identificare un metodo alternativo meno coinvolto e dispendioso in termini di tempo per il loro rilevamento. Il test DLBCL90 è uno strumento importante che risponde a questa esigenza, in cui il razionale per il suo utilizzo è rafforzato dalla scoperta che questo test è in grado di rilevare traslocazioni criptiche alle sonde FISH utilizzate nella diagnostica clinica²⁹.

Il protocollo di macrodissezione sopra descritto delinea un metodo semplice che consente ai ricercatori di aumentare il contenuto tumorale di campioni di tessuto che normalmente scenderebbero al di sotto delle soglie dei criteri di inclusione dello studio comunemente usati. Includere la macrodissezione in un flusso di lavoro di studio consente ai ricercatori di salvare tessuti scarsamente densi di tumore dall’esclusione dello studio aumentando il loro contenuto tumorale. A sua volta, ciò consente una maggiore fiducia che l’RNA e gli eluati di DNA risultanti rappresentino il tumore oggetto di indagine genomica. Sebbene esistano altri metodi più precisi per la dissezione dei tessuti, per i tumori che crescono in modo più espansivo, non infiltrativo, simile a un foglio o solido, la macrodissezione è probabilmente sufficiente. I risultati qui presentati evidenziano l’importanza della purezza del tumore nei saggi genomici e nella macrodissezione come strumento affidabile per raggiungere questo obiettivo.